原位雜交(組織芯片)
服務(wù)介紹:
原位雜交原理:原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交,從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。原位雜交亦可以應(yīng)用于組織芯片的檢測(cè)。結(jié)果更豐富,更具有對(duì)比性。
名稱 | 規(guī)格 |
原位雜交(組織芯片) | 張 |
實(shí)驗(yàn)流程:
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。
2、消化:根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短,切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
3、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室溫避光孵育15min,將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,每次5min。
4、預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。
5、雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過(guò)夜。
6、雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。
7、滴加封閉液:滴加封閉血清 BSA。室溫30min。
8、滴加鼠抗地-高辛標(biāo)記過(guò)氧化物酶(anti-DIG-HRP):傾去封閉液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min,后PBS洗4次×5min。
9、DAB顯色:切片稍甩干后,在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,陽(yáng)性為棕黃色,純水沖洗切片終止顯色。
10、復(fù)染細(xì)胞核:Harris蘇木素復(fù)染3min左右,自來(lái)水洗,1%鹽酸酒精分化數(shù)秒,自來(lái)水洗,氨水返藍(lán),流水沖洗。
11、脫水封片:將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,將切片從二甲苯中拿出稍晾干后,中性樹(shù)膠封片。
15、顯微鏡檢,圖像采集分析。
結(jié)果判讀:
陽(yáng)性為棕黃色,細(xì)胞核為藍(lán)色。
送樣要求:
1、切片前處理要求:新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片;或取2mm左右厚度的新鮮組織,5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定,4℃低溫保存運(yùn)輸,切勿冷凍結(jié)冰,盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率;
2、冰凍切片:冰凍切片-20℃運(yùn)輸;
3、石蠟切片:石蠟切片常溫運(yùn)輸;
4、細(xì)胞爬片:細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,換無(wú)酶PBS,密封,4℃運(yùn)輸。
單據(jù)填寫:
1、探針合成:需提供待測(cè)目的基因序列或基因登錄號(hào)、所需標(biāo)記類型;
2、自帶探針需告知完整探針信息;
3、寫明檢測(cè)要求。