免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測
兔疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測定含量。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)說明：
1、確認(rèn)要做的是單標(biāo)還是雙標(biāo).
2、免疫熒光拍照免費(fèi)。
3、免疫熒光要做預(yù)實(shí)驗(yàn)。
4、全景掃描可看任意倍數(shù)。
冰凍切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟
1、 冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復(fù)溫，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮*干后于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
2、 修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合（試劑1,2為現(xiàn)配現(xiàn)用），加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm）
免疫熒光實(shí)驗(yàn)代測
石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟
1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時間稍微延長）。
2、 修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K儲存液用PBS 1:9稀釋）覆蓋組織，37度溫箱孵育30min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
3、 破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
4、 加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按2:29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、 BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
6、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
7、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
8、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm；FITC綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm）
