質(zhì)譜兼容型蛋白銀染試劑盒
名稱 | 規(guī)格 | 價格 | 手冊 |
質(zhì)譜兼容型蛋白銀染試劑盒 | 10次 | 1390元 |
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銀染是目前檢測PAGE電泳分離后的蛋白質(zhì)的靈敏的方法,MS(質(zhì)譜)是確定未知蛋白常用和快捷的方法,但將銀染得到的蛋白直接用于MS分析有很多問題,其中主要問題是常規(guī)銀染所使用的試劑(包括強(qiáng)氧化劑和醛類)容易使蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)修飾,這樣MS分析得到的氨基酸信息跟蛋白質(zhì)實(shí)際的氨基酸信息并不相同。為了使銀染得到的蛋白質(zhì)可以用于MS分析,為此本公司開發(fā)MS兼容型銀染試劑盒,其特點(diǎn)如下:
1. 跟MS兼容,原理是避免使用能化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的試劑,所得蛋白質(zhì)沒有發(fā)生化學(xué)修飾,故可直接用于后續(xù)的MS(包括MALDI-TOF-MS和ESI-MS)分析。
2. 銀染的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色高100倍左右,可達(dá)0.2-0.6 ng蛋白質(zhì)/條帶。
3. 可用于各種PAGE膠,包括變性PAGE膠(如SDS-PAGE,尿素-PAGE),非變性PAGE膠,IEF膠(等電電泳膠),2D膠等。
4. 四種溶液都是現(xiàn)用現(xiàn)配,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性好。
RNA提取法:試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相,離心后可形成水相層和有機(jī)層,這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟:
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會*分離,當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時,變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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