甲基化檢測(cè)(BSP)
甲基化檢測(cè)(BSP)原理
BSP技術(shù)的核心在于利用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA。在這個(gè)過(guò)程中,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)會(huì)被轉(zhuǎn)化為niaomiding(U),而甲基化的胞嘧啶則保持不變。隨后,通過(guò)PCR擴(kuò)增處理后的DNA片段,在擴(kuò)增過(guò)程中,niaomiding(U)會(huì)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)。最后,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)比對(duì)測(cè)序結(jié)果中的胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的比例,可以判斷原始DNA中CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
BSP技術(shù)步驟
?DNA提取與純化?:首先,從待測(cè)樣本中提取基因組DNA,并進(jìn)行純化以去除雜質(zhì)。
?亞硫酸氫鹽處理?:將純化后的DNA用亞硫酸氫鹽進(jìn)行處理,使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為niaomiding。
?PCR擴(kuò)增?:設(shè)計(jì)特異性引物,對(duì)處理后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增過(guò)程中niaomiding轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。
?克隆與測(cè)序?:將PCR產(chǎn)物克隆至載體中,挑取多個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果將反映CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。
?數(shù)據(jù)分析?:將測(cè)序結(jié)果與原始DNA序列進(jìn)行比對(duì),統(tǒng)計(jì)甲基化位點(diǎn)及數(shù)量,分析甲基化程度。
BSP技術(shù)特點(diǎn)
?高靈敏度?:BSP技術(shù)能夠檢測(cè)單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),具有jigao的靈敏度。
?單堿基分辨率?:該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基水平的甲基化檢測(cè),提供詳細(xì)的甲基化圖譜。
?定量分析能力?:通過(guò)統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果中的C/T比例,可以計(jì)算出精確的甲基化程度百分比。
?實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜?:然而,BSP技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)較多,且成本較高,需要一定的實(shí)驗(yàn)技能和經(jīng)驗(yàn)。