Tte AP 熱穩(wěn)定核酸酶

ThermoStable dsAP Nuclease (耐熱雙鏈特異性AP 核酸內切酶) 來源于嗜熱菌，是一種熱穩(wěn)定的特異性識別雙鏈脫嘌呤/脫嘧啶(AP)位點的核酸內切酶。該酶可
切割 AP 位點 5’端的個磷酸二酯鍵，產生 3′羥基和 5′脫氧核糖磷酸末端(deoxyribose phosphate, dRP)。
該酶作用底物為雙鏈 DNA(含 AP 位點)，對單鏈DNA(含 AP 位點)、ssDNA、dsDNA 無活性。該酶的活性溫度為 60-70°C，在 85°C 以上溫度逐步失活。

單位定義：
一單位指，在 10μl 反應體系中，60°C 反應 15min，切割1 pmol 含一個 AP 位點的寡核苷酸雙鏈，所需要的酶量。
1×dsAP Buffer：10mM Tris-HCl，pH7.8； 50mM KCl；0.1% Tween20；0.02% BSA, 5mM Mg2+。
酶儲存液：20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1mM EDTA, 50% Glycerol, pH 7.8。
使用方法
含 AP 位點的 DNA 2-20pmol
10xdsAP Buffer 2 μl
ThermoStable dsAP Nuclease 1 μl
ddH2O Up to 20 μl
60°C 反應 15-30min

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，第鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優(yōu)化。