Hi T7 RNA Polymerase

描述：Hi T7 RNA Polymerase 對(duì) T7 噬菌體啟動(dòng)子具有高 度的特異性，并可以其作為啟動(dòng)子，DNA 作為模板體外 合成正義鏈。雙鏈線性質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物均可作為該 酶的底物模板。 Hi T7 RNA 聚合酶經(jīng)電子重構(gòu)架及庫(kù)篩選，與 Wild 型比較來(lái)看，酶的 DNA 模板結(jié)合區(qū)域親和力更高，使其 具有持續(xù)合成能力，從而獲得更高的產(chǎn)量，并易于長(zhǎng)片段 RNA 的合成。該酶為重組純化制品，無(wú) DNase 和 RNase 污染。

活性定義：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，37℃ 1 小時(shí)內(nèi)將 1 nmol的 ATP 摻入酸不溶物所需要的酶量定義為一個(gè)活性單位。
儲(chǔ)存：置于-20°C 可保存 2 年，如有白色沉淀析出，37°C溫浴 5min 后使用，不影響性能。
熱失活：75°C，10min。
操作方法
1.配制反應(yīng)體系
10XHi T7 TransBuffer 2 μl
rNTP Mixture (25 mM each) 3.2 μl
Linearized template DNA 0.5-1 μg
RNase Inhibitor （40U/μl） 0.5 μl
Hi T7 RNA Polymerase (100 U/μl) 0.5-1 μl
DEPC-treated Water up to 20 μl
2. 37℃孵育 2-3h (通常 3h，即可獲得>80 μg 的總產(chǎn)量)。
3. 反應(yīng)完畢后，如需去除模板 DNA，加入 Dnase I（2U）37℃處理 15min。
4. 終止反應(yīng)：75℃加熱 10min，或加入 2 μl 0.5M 的 EDTA(pH8.0)。
注意事項(xiàng)
1.質(zhì)粒DNA的質(zhì)量影響RNA的量和完整性。質(zhì)粒DNA的濃度越高，生成RNA的質(zhì)量越高，質(zhì)粒模板DNA應(yīng)該無(wú)RNase污染.
2.該酶為高產(chǎn)酶，RNA 產(chǎn)量高，在反應(yīng)完畢后，通常存在肉眼可見(jiàn)的渾濁狀態(tài)，其為反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂，此時(shí)表明反應(yīng)劇烈。在下一步 RNA 純化前，可通過(guò)短暫離心去除沉淀物，此過(guò)程并不丟失 RNA。
3. 通常轉(zhuǎn)錄后 RNA 產(chǎn)物濃度在 2-4 μg/μl，因此電泳時(shí)，僅需取 0.05-0.1 μl 即可。
4. 關(guān)于 T7 啟動(dòng)子序列：（G/C）標(biāo)示 G 或 C 堿基均可。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。