RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 熒 光 法 進(jìn) 行Real-Time PCR 的專(zhuān)用試劑，本 SYBR Green qPCR Mix將化學(xué)修飾的熱啟動(dòng) RAPA3G DNA 聚合酶、反應(yīng) Buffer、dNTP、SYBR Green 染料等試劑預(yù)混在一起，是一種 2×濃度的單組分預(yù)混試劑。該制品配有單獨(dú)的 ROX 內(nèi)參染料，可用于需要 ROX 進(jìn)行孔間校正的定量 PCR 儀。RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，其具有的雜質(zhì)耐受性（對(duì)乙醇、胍鹽、肝素具有高的耐受性），因此對(duì)于純度較差的 DNA 模板，該 Mix 仍然可以獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。RAPA3G DNA 聚合酶為化學(xué)法修飾的 HotStart版本，其在 50℃以下 無(wú)活性，只有 95℃條件下加熱5min 后才能恢復(fù)酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制非特異性 PCR 擴(kuò)增，極大的提高了 PCR 擴(kuò)增特異性。該試劑盒的反應(yīng)緩沖液，可在寬范圍中得到良好的擴(kuò)增結(jié)果、檢測(cè)靈敏度更高、信號(hào)更強(qiáng)。
包裝
規(guī) 格
2×RAPA3G SYBR
Green qPCR Mix
50×ROX Dye
1ml （A2250A） 1 ml 200 μl
5ml （A2250B） 1 ml×5 200 μl
儲(chǔ)存：
請(qǐng)避光置于-20℃以下可保存３年。該試劑經(jīng) 30 次凍融后性能無(wú)下降，因此不使用時(shí)請(qǐng)置于-20℃避光保存。
操作方法
1. 根據(jù)機(jī)型選擇步驟 A 或 B
A: 需要添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的 Real-TimePCR 儀，包括：ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 FastReal-Time PCR (Applied Biosystems)；Mx3000P(Stratagene)等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：終濃度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意：引物用量有時(shí)可提高到 0.8 μl 以提高擴(kuò)增效率。B:無(wú)需添加 ROX 染料進(jìn)行反應(yīng)孔間信號(hào)矯正的 Real-TimePCR 儀，包括：LightCycler (Roche Diagnostics)； CFX96Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：終濃度
2×RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng),通常采用兩步法，程序如下：
Stage 1: 95℃ 5min*
Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 20s 40 cycles
Stage 3: Dissociation analysis
注意：由于該酶為化學(xué)修飾的熱啟動(dòng) RAPA3G DNA 聚合酶，必須于 95℃加熱 5min 才能恢復(fù)酶的活性，該熱啟動(dòng)步驟不能縮短時(shí)間。
3. 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR 的擴(kuò)增曲線(xiàn)、融解曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為T(mén)A克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類(lèi)的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。