Amplite 熒光法草酰乙酸檢測試劑盒 紅色熒光是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測草酰乙酸的試劑盒，草酰乙酸是檸檬酸循環(huán)的重要組成部分，它與乙酰*酶A反應(yīng)生成檸檬酸鹽。它還涉及糖異生，尿素循環(huán)，乙醛酸循環(huán)，氨基酸合成和脂肪酸合成。草酰乙酸的缺乏限制了糖原異生和尿素循環(huán)功能，并且可以導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少。草酰乙酸也可用作血液谷*酸劑，在創(chuàng)傷性腦損傷后提供神經(jīng)保護，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元損失減少和神經(jīng)功能。Amplite™熒光草酰乙酸檢測試劑盒為生物樣品中的草酰乙酸定量提供了靈敏的檢測方法。草酰乙酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，通過酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫。通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 540 / 590nm下用Amplite™Red監(jiān)測過氧化氫的產(chǎn)生。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法草酰乙酸檢測試劑盒。
96孔板測定示例
概述
準(zhǔn)備測試樣品（50μL）和連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（50μL）
加入等體積的測定混合物（50μL）
在室溫下孵育
監(jiān)測熒光強度在Ex / Em = 540/590 nm
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。
操作方法
1.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品：
1.1將100μLDdH2O加入草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（組分E）中，制成100mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2制備草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)稀釋液：將10μL100mM草酰乙酸鹽（來自步驟1.1）加入990μL測定緩沖液（組分C）中，得到1mM草酰乙酸溶液。 將100μL的1mM草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入900μL測定緩沖液中以制備100μM草酰乙酸溶液。進行1：3連續(xù)稀釋，得到約30,10,3,1,0.3和0.1μM連續(xù)稀釋的草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品。
1.3根據(jù)說明書中的表1，將50μL含草酰乙酸的樣品和連續(xù)稀釋的草酰乙酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。
2.準(zhǔn)備草酰乙酸測定混合物：
2.1制作Amplite 紅色底物原液（200X）：將50μLDMSO（組分F）加入Amplite Red底物（組分A）中，制成200X Amplite Red底物原液。
2.2制備草酰乙酸脫羧酶（OAC）儲備溶液（100X）：將50μLddH 2 O加入草酰乙酸脫羧酶（組分D）中以制備100μL草酰乙酸脫羧酶原液。
2.3制備測定混合物：將5mL測定緩沖液（組分C）加入一個酶混合瓶（組分B）中充分混合。 將50μLOAC儲備溶液（來自步驟2.2）和25μL200X Amplite Red儲備溶液（來自步驟2.1）轉(zhuǎn)移到瓶中并充分混合。
注意1：分析混合物不穩(wěn)定，及時使用，避免直接暴露在光線下。
注意2：將未使用的200X Amplite Red原液儲存在-20℃，避免光照和反復(fù)凍融循環(huán)。
3.運行草酰乙酸測定：
3.1將50μL測定混合物（來自步驟2.3）添加到草酰乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟1.3），以使總草酰乙酸測定體積為100μL/孔。
注1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品，25μLAssay混合液。
注2：在pH 6.5至7.0下進行草酰乙酸測定。
3.2在室溫下孵育反應(yīng)混合物30分鐘至1小時。
3.3使用熒光板讀數(shù)器在Ex / Em = 540 / 590nm（截止：570nm）監(jiān)測熒光增加。
