Amplite 熒光法賴氨酰氧化酶檢測(cè)試劑盒 紅色熒光是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)賴氨酸氧化酶的試劑盒。賴氨酰氧化酶是一種細(xì)胞外酶，其催化從膠原蛋白和彈性蛋白前體中的賴氨酸殘基形成醛。 這些醛具有高反應(yīng)性，并與其他賴氨酰氧化酶衍生的醛殘基或未修飾的賴氨酸殘基發(fā)生自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)。 化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)，這對(duì)于穩(wěn)定膠原纖維和成熟彈性蛋白的完整性和彈性是必需的。 生物樣品中賴氨酰氧化酶的活性傳統(tǒng)上通過(guò)使用放射性同位素標(biāo)記的膠原蛋白或彈性蛋白底物的氚釋放終點(diǎn)測(cè)定來(lái)評(píng)估。

Amplite 熒光Lysyl氧化酶檢測(cè)試劑盒提供靈敏的熒光檢測(cè)，用于檢測(cè)賴氨酰氧化酶的活性。 它利用專有的LOX底物，在HRP偶聯(lián)反應(yīng)中使用我們的Amplite ADHP底物釋放過(guò)氧化氫。 該方法允許檢測(cè)亞ng / mL賴氨酰氧化酶，并且比目前可用的測(cè)定靈敏得多。 它除了某些生物樣品中發(fā)生的干擾，可以很容易地用于檢測(cè)細(xì)胞提取物或溶液中的賴氨酰氧化酶活性。 其信號(hào)可通過(guò)Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標(biāo)儀或~576 nm的吸光度酶標(biāo)儀輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法賴氨酰氧化酶檢測(cè)試劑盒 。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備測(cè)定反應(yīng)混合物（50μL）

添加賴氨酰氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

在37℃孵育10-30分鐘

在Ex / Em = 540/590 nm處監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。

操作方法

1.準(zhǔn)備試劑：

注意1：在硫醇如DTT，谷*甘肽（還原型：GSH）和β-巰基乙醇存在下，Amplite™HRP底物不穩(wěn)定。濃度高于10μM的硫醇的存在將顯著降低測(cè)定動(dòng)態(tài)范圍。

注意2：某些洗滌劑（如Brij-35，Tween-20和NP40），NADH和NADPH也會(huì)干擾檢測(cè)。

1.1 250X Amplite™HRP底物儲(chǔ)備液：將100μLDMSO（組分D）加入到Amplite™HRP底物（組分A）的小瓶中。應(yīng)及時(shí)使用原液; 任何未使用的溶液應(yīng)等分并在-20℃重新冷凍。

注意：避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.2 50U / mL辣根過(guò)氧化物酶儲(chǔ)備溶液：將1mL測(cè)定緩沖液（組分B）加入到辣根過(guò)氧化物酶（組分C）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備測(cè)定反應(yīng)混合物：

根據(jù)說(shuō)明書中的表格制備測(cè)定反應(yīng)混合物并避光。

3.在上清液中進(jìn)行賴氨酰氧化酶測(cè)定：

3.1將50μL測(cè)定反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2）加入到賴氨酰氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品（參見步驟2，表3）的每個(gè)孔中，以使總賴氨酰氧化酶測(cè)定體積為100μL/孔。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μL測(cè)定反應(yīng)混合物。

3.2在37℃下孵育反應(yīng)10至30分鐘，避光。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。

注意：也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，并用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長(zhǎng)下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。

4.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行賴氨酰氧化酶測(cè)定：

Amplite™熒光Lysyl氧化酶檢測(cè)試劑盒可用于測(cè)量細(xì)胞中活性賴氨酰氧化酶的釋放。 以下是建議的說(shuō)明，可根據(jù)您的特定研究需求進(jìn)行修改。

4.1在96孔板（50-100μL/孔）中制備細(xì)胞，并根據(jù)需要活化細(xì)胞。

注意：包括陰性對(duì)照（單獨(dú)培養(yǎng)基和非活化細(xì)胞）用于測(cè)量背景熒光。

4.2將50 µL賴氨酰氧化酶工作溶液添加到細(xì)胞培養(yǎng)基的每個(gè)孔中（來(lái)自上一步）和賴氨酰氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品的孔中（參見表1）。 對(duì)于384孔板，請(qǐng)向每個(gè)孔中添加25 µL工作溶液。

注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL細(xì)胞培養(yǎng)基和25μL測(cè)定反應(yīng)混合物。

4.3在37℃下孵育反應(yīng)10至30分鐘，避光。

4.4使用熒光讀板儀在Ex / Em = 530至570/590至600 nm（大Ex / Em = 540/590 nm）下觀察熒光增加。