Amplite NADP+/NADPH檢測(cè)試劑盒（熒光法）紅色熒光是AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NADP+/NADPH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。通過(guò)光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。
現(xiàn)有的NADP / NADPH測(cè)定通過(guò)吸收在UV范圍內(nèi)進(jìn)行。該測(cè)定具有低靈敏度和高干擾。這種Amplite™熒光總NADP和NADPH檢測(cè)試劑盒為敏感檢測(cè)NADP和NADPH提供了一種便捷的方法。系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NADP / NADPH，其顯著提高了檢測(cè)靈敏度。此外，該測(cè)定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見(jiàn)范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了生物樣品的干擾。無(wú)需從樣品混合物中純化NADP / NADPH。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADP+/NADPH檢測(cè)試劑盒（熒光法）
Amplite™熒光總NADP和NADPH分析試劑盒提供靈敏的一步法分析，可在100μL分析體積（10 nM;圖1）中檢測(cè)少至1皮摩爾的NADP（H）。該測(cè)定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，并且易于適應(yīng)自動(dòng)化。 其信號(hào)可通過(guò)Ex / Em = 540/590 nm的熒光酶標(biāo)儀或~576 nm的吸光度酶標(biāo)儀輕松讀取。紅色發(fā)射時(shí)間越長(zhǎng)，生物樣品的自發(fā)熒光干擾越小。
96孔板測(cè)定示例
概述
準(zhǔn)備NADP / NADPH反應(yīng)混合物（50μL）
加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）
在室溫下孵育15分鐘--2小時(shí)
監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度
注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。
操作方法
1.準(zhǔn)備NADPH原液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADPH儲(chǔ)備溶液。
注意：未使用的NADPH原液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
2.制備NADP / NADPH反應(yīng)混合物：
將10mL NADP / NADPH傳感器緩沖液（組分B）加入NADP / NADPH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
注意：這種NADP / NADPH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔板。 未使用的NADP / NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
3.準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至10μM）：
3.1將10μLNADPH儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟1）加入990L PBS緩沖液中以產(chǎn)生10M（10pmol / L）NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
3.2取200μL10μMNADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01,0.003和0μM連續(xù)稀釋液。
3.3如表1和2中所述，將含有NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含NADP / NADPH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。
注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
表1.實(shí)心黑色96孔微孔板中NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注意：NS = NADPH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品。
表2.每個(gè)孔的試劑組成
NADPH Standard | Blank Control | Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL | PBS: 50 μL | 50 μL |
注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品從0.003μM至3μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADPH（例如，>100μM，終濃度）可能由于NADPH傳感器（對(duì)非熒光產(chǎn)物）的過(guò)度氧化而導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。
4.在上清液中運(yùn)行NADP / NADPH測(cè)定：
4.1將50μLNADPH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見(jiàn)步驟3.3），使總NADPH測(cè)定體積為100μL/孔
注意：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應(yīng)混合物。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。
4.3在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（佳540 / 590nm）下用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。
注意1：也可將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。
注意2：對(duì)于NADP / NADPH比率測(cè)量，建議使用Cat#15264。
注意3：對(duì)于基于細(xì)胞的NADP / NADPH測(cè)量，建議使用ReadiUse™哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解緩沖液* 5X *（Cat#20012）裂解細(xì)胞。
