Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)是AAT Bioquest研發(fā)的檢測NAD+/NADH的試劑盒。煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。 通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。
傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來進行。 Amplite™熒光總NAD和NADH檢測試劑盒為敏感檢測NAD和NADH提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因為其在紅色可見范圍內(nèi)運行，這顯著降低了生物樣品引起的干擾。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD+/NADH檢測試劑盒(比色法)
Amplite 比色NAD / NADH檢測試劑盒提供靈敏的一步法檢測，可在100μL檢測體積（300 nM;圖1）中檢測少至30皮摩爾的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔板進行檢測。 其信號可通過光吸收酶標儀在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下輕松讀取，以提高測定靈敏度。
96孔板測定示例
概述
準備NAD / NADH反應(yīng)混合物（50μL）
添加NADH標準品或測試樣品（50μL）
在室溫下孵育15分鐘--2小時
檢測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度
操作方法
1.準備NADH儲備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH儲備溶液。
注意：未使用的NADH儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
2.準備NAD / NADH反應(yīng)混合物：
將10mL NAD / NADH緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。
注意：NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。
3.準備NADH標準品的系列稀釋液（0至10μM）：
3.1將10μL的NADH儲備溶液（來自步驟1）加入到990L PBS緩沖液（pH 7.4）中，以產(chǎn)生10μM（10pmol / L）NADH標準溶液。
注意：稀釋的NADH標準溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。
3.2取200μL 10μM NADH標準溶液進行1：3連續(xù)稀釋，得到NADH標準品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續(xù)稀釋液。
3.3如表1和2中所述，將含有NADH標準品和含NAD / NADH的測試樣品的系列稀釋液加入到黑色96孔板中。
注意：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。
表1黑色96孔板中NADH標準品和測試樣品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注意：NS = NADH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品。
表2.每個孔的試劑組成
NADH Standard | Blank Control | Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL | PBS: 50 μL | 50 μL |
注意：將連續(xù)稀釋的NADH標準品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>100μM，終濃度）可能由于NADH探針（對非熒光產(chǎn)物）的過度氧化而導(dǎo)致熒光信號降低。
4.在上清液反應(yīng)中運行NAD / NADH測定：
4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標準品，空白對照和測試樣品（來自步驟3.3）的每個孔中，使得總NADH測定體積為100μL/孔。
注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時，避光。
4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的熒光酶標儀檢測熒光。
注1：也可將板的混合物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，用吸光度酶標儀在576±5nm波長下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。
注意2：對于NAD / NADH比率測量，建議使用試劑盒15263。
注意3：對于細胞的NAD / NADH檢測，建議使用ReadiUse 哺乳動物細胞裂解緩沖液* 5X *（貨號：20012）裂解細胞。
