Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NADH的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙X胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADH檢測試劑盒為檢測NADH提供了一種便捷的方法。 NADH探針是一種生色傳感器，在NADH減少時(shí)具有460nm的大吸光度。 NADH探針的吸收與溶液中NADH的濃度成正比。 Amplite 比色NADH分析試劑盒提供靈敏的分析，可在100μL分析體積中檢測低至3μM的NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADH檢測試劑盒(比色法)。
96孔板檢測示例
概述
準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物（50μL）
加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）
在室溫下孵育持續(xù)15分鐘至2小時(shí)
監(jiān)測460nm處的吸光度
注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)
操作步驟
1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。
注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
2.準(zhǔn)備NADH反應(yīng)混合物：
將1mL NADH探針（組分A）加入4mL NADH測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADH反應(yīng)混合物用于一個(gè)96孔。未使用的NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
3.準(zhǔn)備NADH標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至100μM）：
3.1將100μL的NADH儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）加入到400μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，以產(chǎn)生200μM（100pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。 注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
3.2取200μL的200μMNADH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到NADH標(biāo)準(zhǔn)品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續(xù)稀釋液。
3.3如表1和2所述，將NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔板中。
注意：根據(jù)需要制備細(xì)胞或組織樣品。
表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注意：NS = NADH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對照，TS =測試樣品。
表2.每個(gè)孔的試劑
| 孔 | 體積 | 試劑 |
| NS1 - NS7 | 50 µL | 連續(xù)稀釋 (3.13 to 200 µM) |
| BL | 50 µL | PBS |
| TS | 50 µL | 測試樣品 |
*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。
4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADH測定：
4.1將50μL的NADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟3.3），使總NADH測定體積為100μL/孔
注意1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADH反應(yīng)混合物。
注意2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞。（詳見附錄）。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。
4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。
