Amplite NAD檢測試劑盒 （熒光法）藍(lán)色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NAD的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其氧化形式（NAD）是活細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的許多酶反應(yīng)的必需輔助因子。 量化這些因子的產(chǎn)生或消耗是監(jiān)測酶介導(dǎo)的反應(yīng)或篩選這些酶反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑或底物的重要方法。 市場上有幾種用于量化NADH或總NAD / NADH量的試劑盒，但是迄今為止在大量過量NADH存在下檢測NAD是非常具有挑戰(zhàn)性的，因為NAD在259 nm處具有其吸收峰且不發(fā)熒光， 使測量不實用。
Amplite 熒光NAD分析試劑盒可便捷，快速地檢測NAD。 該試劑盒使用我們新開發(fā)的NAD傳感器Quest Fluor NAD試劑直接測量NAD。 該試劑盒中使用的專有探針僅與NAD反應(yīng)產(chǎn)生在Ex / Em = 420 / 480nm處熒光的產(chǎn)物，并且對NADH幾乎沒有響應(yīng)。 該試劑盒可在100μL測定體積中檢測少至30 nM的NAD，并在過量的NADH存在下監(jiān)測0.3％的NAD產(chǎn)生。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，并且可以用于高通量篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD檢測試劑盒 （熒光法）藍(lán)色熒光。
實驗方案
96孔板檢測示例
概述
準(zhǔn)備NAD標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50μL）
添加20μLQuestFluor NAD探針添加20μL
測定溶液在室溫下孵育10-20分鐘
添加15μL增強劑溶液
在室溫下孵育10-20分鐘
監(jiān)測420/480 nm的熒光
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分。
操作步驟
1.準(zhǔn)備NAD庫存解決方案：
將500μlddH2 O加入到NAD標(biāo)準(zhǔn)品（組分D）的小瓶中以制備1mM NAD儲備溶液。
注意：未使用的NAD儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 ℃。
2.準(zhǔn)備NAD標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液（0至10μM）：
2.1將10μLNAD儲備溶液（來自步驟1）加入990L H2O或PBS緩沖液中以產(chǎn)生10M NAD標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意：稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。
2.2取200μL10μMNAD標(biāo)準(zhǔn)溶液，在H2O或PBS中進行1：3連續(xù)稀釋，得到NAD標(biāo)準(zhǔn)品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續(xù)稀釋液。
2.3如表1所述，將50μL系列稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD的測試樣品加入黑色/固體底96孔微孔板中：
表1在黑色/固體底96孔微孔板中的NAD標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注1：NS = NAD標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對照，TS =測試樣品。
注2：將連續(xù)稀釋的NAD標(biāo)準(zhǔn)品從10μM加到0.01μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。
3.運行NAD測定：
3.1將20μLQuestFluor NAD探針（組分A）溶液加入NAD標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照品和測試樣品的每個孔中，充分混合。
3.2將20μL測定溶液（組分B）加入每個孔中，充分混合。
注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和10μLQuestFluor™NAD Probe和10μLAssaySolution。
3.3在室溫下孵育反應(yīng)10-20分鐘，避光。
3.4向每個孔中加入15μL增強劑（組分C），使總NAD測定體積為105μL/孔，并在室溫下孵育10-20分鐘，避光。
注意：對于384孔板，添加7.5 uL增強劑。
3.5使用熒光板讀數(shù)器在420/480 nm處檢測熒光增加。
