Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒 （比色法）是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NADP/NADPH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是細胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔酶。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的還原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化還原反應中起輔助因子的作用，在細胞反應中轉(zhuǎn)移電子。 氧化形式和還原形式之間的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 該比率是指示細胞氧化還原狀態(tài)的重要組分，并且它是反映代謝活性和細胞健康的測量。 在健康的哺乳動物組織中，游離NAD和NADH之間的比率的估計可以高達700。相反，NADP / NADPH比率通常為約0.005，因此NADPH是該輔酶的主要形式。

該Amplite 比色NADP / NADPH比率分析試劑盒提供了一種比色法，用于測量培養(yǎng)細胞中細胞內(nèi)總NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在該測定中，裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取，然后通過NADPH探針識別，在反應后得到黃色染料，其在460nm處具有吸光度。 產(chǎn)生的染料量與細胞裂解物中NADP或NADPH的濃度成正比，可用作細胞NADP / NADPH濃度的指示劑。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADP/NADPH比率檢測試劑盒(比色法)。

實驗方案

96孔板檢測示例

概述

準備25μLNADPH標準品和/或測試樣品

加入25μLNADPH提取液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μL中和溶液

加入75μLNADPP/ NADPH反應混合物在室溫下孵育15分鐘至2小時監(jiān)測 在460nm處的吸光度

注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作步驟

1.準備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH儲備溶液。

注意：未使用的NADPH原液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.制備NADP / NADPH反應混合物：

2.1將8mL NADPH探針緩沖液（組分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

2.2將2 mL NADPH探針（組分B-I）加入上述瓶中（來自步驟2.1）并充分混合。

注意：這種NADP / NADPH反應混合物足以進行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備連續(xù)稀釋的NADPH標準品（0至2μM）：

3.1將2L 1mM NADPH儲備溶液（來自步驟1）加入998L PBS緩沖液（pH7.4）中，產(chǎn)生2M（2 pmols / L）NADPH標準溶液。

注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩(wěn)定，應在4小時內(nèi)使用。

3.2取200μL2MNADPH標準溶液（來自步驟3.1）進行1：2連續(xù)稀釋，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀釋的NADPH標準品。

4.運行總NADP / NADPH分析（總共400個分析/試劑盒）：

4.1如說明書中的表1和2中所述，將NADPH標準品和含有NADP / NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微孔板中。

注意：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞。 （詳見附錄）。

4.2將50μL的NADP / NADPH反應混合物（來自步驟2.2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品（來自步驟4.1）的每個孔中，以使總NADP / NADPH測定體積為100μL/孔。

4.3在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。

4.4使用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。

5.運行NADP / NADPH比率分析（總共250個分析/試劑盒）：

5.1如說明書中的表3和4中所述，將連續(xù)稀釋的NADPH標準品和/或含NADP / NADPH的測試樣品加入白色/透明96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞。

5.2對于NADPH提?。∟ADPH量）：將25μLNADPH提取溶液（組分D）加入含有NADP / NADPH的測試樣品的孔中。在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μL中和溶液（組分E）以中和NADPH提取物，如說明書中的表3和4中所述。

對于總NADP和NADPH（總量）：將25μLNADPP/ NADPH對照溶液（組分F）加入NADPH標準品的孔和含有NADP / NADPH的測試樣品中。在室溫下孵育10至15分鐘，然后如說明書中的表3和4中所述添加25μL提取對照溶液（組分F）。

注意：根據(jù)需要準備細胞或組織樣本。為方便起見，裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細胞（詳見附錄）。

5.3將75μL的NADP / NADPH反應混合物（來自步驟2.2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品（NADP / NADPH）的每個孔中，并測試樣品（NADPH提取物）（來自步驟5.1）以使總量達到測定體積為150μL/孔。

5.4在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。

5.5使用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。