iFluor 840酸 熒光染料是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的，iFluor 染料是一系列優(yōu)秀的熒光標(biāo)記染料，可以覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光譜。所有iFluor 染料都具有優(yōu)異的水溶性。它們的親水性使有機(jī)溶劑的使用極小化。iFluor 染料也具有比經(jīng)典熒光標(biāo)記染料更好的標(biāo)記性能，如FITC，TRITC，Texas Red ，Cy3 ，Cy5和Cy7。一些iFluor 染料在某些抗體上明顯優(yōu)于Alexa Fluor 標(biāo)記染料。它們是用于標(biāo)記蛋白質(zhì)和核酸而不包含性能的極便宜的熒光染料（替代Alexa Fluor 染料）。每種iFluor染料的開(kāi)發(fā)都與特定的Alexa Fluor 或其他標(biāo)記染料（如DyLight 染料）的光譜特性相匹配。
琥珀酰亞胺基（NHS）酯被證明是用于胺修飾的試劑，因?yàn)樾纬傻孽０锋I基本上與天然肽鍵相同并且穩(wěn)定。這些試劑通常是穩(wěn)定的并且與脂族胺顯示出良好的反應(yīng)性和選擇性。當(dāng)琥珀酰亞胺酯化合物用于綴合反應(yīng)時(shí)，需要考慮的因素很少：1）溶劑：在大多數(shù)情況下，活性染料應(yīng)溶于無(wú)水二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中。 2）反應(yīng)pH：胺與琥珀酰亞胺酯的標(biāo)記反應(yīng)強(qiáng)烈依賴于pH。胺反應(yīng)性試劑與非質(zhì)子化脂族胺基團(tuán)反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)的末端胺和賴氨酸的β-氨基。因此，胺?；磻?yīng)通常在pH 7.5以上進(jìn)行。通過(guò)琥珀酰亞胺酯進(jìn)行的蛋白質(zhì)修飾通常可以在pH 8.5-9.5下進(jìn)行。 3）反應(yīng)緩沖液：使用胺反應(yīng)試劑時(shí)，必須避免使用含有游離胺（如Tris和*）和硫醇化合物的緩沖液。廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）也必須在進(jìn)行染料綴合之前除去（例如通過(guò)透析）。 4）反應(yīng)溫度：大多數(shù)綴合在室溫下進(jìn)行。然而，特定標(biāo)記反應(yīng)可能需要升高或降低的溫度。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的iFluor 840酸 熒光染料。
染色樣本分析
操作步驟
1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液（溶液A）：
將100μL反應(yīng)緩沖液（如1 M碳酸鈉溶液或1 M磷酸鹽緩沖液，pH~9.0）與900μL目標(biāo)蛋白溶液（如抗體，蛋白質(zhì)濃度> 2 mg / ml，如果可能）混合至100μL給予1 mL蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。
注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的pH值應(yīng)為8.5±0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的pH低于8.0，則使用1M碳s氫鈉溶液或1M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH調(diào)節(jié)至8.0-9.0的范圍。
注2：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘an酸緩沖液中，則必須用pH7.2-7.4的1X PBS透析，以除去廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注3：不純抗體、牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩(wěn)定的抗體不會(huì)被很好標(biāo)記。疊d化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)透析或旋轉(zhuǎn)柱除去疊d化鈉或硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。
注4：如果蛋白質(zhì)濃度低于2 mg / mL，則結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為獲得標(biāo)記效率，建議極終蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10 mg / mL。
2.準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）：
將無(wú)水DMSO加入到iFluor 染料SE小瓶中以制備10-20mM儲(chǔ)備溶液。 通過(guò)移液或渦旋混合均勻。
注意：在開(kāi)始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）。 及時(shí)使用。 染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可降低染料活性。 溶液B可在冰箱中保存兩周，避光保存。 避免凍融循環(huán)。
3.確定染料/蛋白質(zhì)比例（可選）：
注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能不利地影響其結(jié)合親和力，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。我們建議您通過(guò)使用連續(xù)不同量的標(biāo)記染料溶液重復(fù)步驟4和5來(lái)實(shí)驗(yàn)確定染料/蛋白質(zhì)比率。通常，對(duì)于大多數(shù)染料 - 蛋白質(zhì)綴合物，推薦使用4-6種染料/蛋白質(zhì)。
3.1使用10：1摩爾比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始點(diǎn)：將5μl染料儲(chǔ)備溶液（溶液B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為10 mM）加入到樣品瓶中。蛋白質(zhì)溶液（95μl溶液A）有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg / mL并且蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，蛋白質(zhì)的濃度為~0.05mM。
注意：蛋白質(zhì)溶液中DMSO的濃度應(yīng)<10％。
3.2運(yùn)行綴合反應(yīng)（參見(jiàn)下面的步驟4）。
3.3重復(fù)＃3.2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1;分別為15：1和20：1。
3.4使用預(yù)制的旋轉(zhuǎn)柱純化所需的綴合物。
3.5計(jì)算上述4種結(jié)合物的染料/蛋白質(zhì)比（DOS）（見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。
3.6運(yùn)行上述4種結(jié)合物的功能測(cè)試，確定的染料/蛋白質(zhì)比例，以擴(kuò)大標(biāo)記反應(yīng)。
4.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：
4.1有效加入適量的染料儲(chǔ)備溶液（溶液B）到蛋白質(zhì)溶液（溶液A）的小瓶中晃動(dòng)。
注意：溶液B /溶液的摩爾比由步驟3.6確定。如果跳過(guò)步驟3，我們建議使用10：1溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）的摩爾比。
4.2繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。
5.純化綴合物
以下方案是使用Sephadex G-25柱純化染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的實(shí)例。
5.1按照制造說(shuō)明準(zhǔn)備Sephadex G-25色譜柱。
5.2將反應(yīng)混合物（直接從步驟4）加載到Sephadex G-25柱的頂部。
5.3樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行時(shí)立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
5.4向所需樣品中加入更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。 合并含有所需染料 - 蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。
注1：立即使用時(shí)，染料 - 蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。
注2：對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料 - 蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥
