盡管單次使用已非全新的理念，并且在囊式過濾器和貯存袋之類的產(chǎn)品中已經(jīng)成為標(biāo)準(zhǔn)操作，當(dāng)下單次使用工藝比常規(guī)的生產(chǎn)方法更為復(fù)雜，由集成模塊構(gòu)成——尤其是在新設(shè)備中——通常替代了原來的不銹鋼設(shè)備。
目前單次使用技術(shù)被*是可以減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，降低投資風(fēng)險(xiǎn)，具備更大的靈活性，可以為試驗(yàn)用藥品提供具有成本效益的產(chǎn)品開發(fā)方案。單次使用生物反應(yīng)器問世尚未超過20 年，考慮到諸如此類的因素，可以認(rèn)為這種技術(shù)在如此短的時(shí)間之內(nèi)呈現(xiàn)出迅猛發(fā)展，推陳出新的發(fā)展態(tài)勢(shì)。
當(dāng)前，得益于單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)領(lǐng)域中菌株的優(yōu)化和培養(yǎng)基的改善，分批補(bǔ)料式哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的生產(chǎn)效率已經(jīng)顯著提升。生物量濃度已經(jīng)從1-3 g/L 增至7-10 g/L，因此促進(jìn)了較小規(guī)模的生產(chǎn)容器的運(yùn)用，不過與此同時(shí)，也讓下游的工藝面臨更多的難題。[1,2] 產(chǎn)量更大、濃度更高，深層過濾器難以進(jìn)行處理。對(duì)大于500 L 的體積，要降低生產(chǎn)成本并減少浪費(fèi)，離心機(jī)的使用。
運(yùn)用即用型澄清系統(tǒng)，高達(dá)2,000L 的體積都可實(shí)現(xiàn)單次使用處理，這樣商業(yè)可行的方案，在一個(gè)步驟內(nèi)就能替代離心機(jī)和深層過濾器。
圖片由賽多利斯公司提供
收集技術(shù)
高產(chǎn)品滴度源自于細(xì)胞密度的增加而非每一種細(xì)胞單位生產(chǎn)率的提升，所以固體量會(huì)明顯增大，常規(guī)的收集技術(shù)難以應(yīng)對(duì)。
目前，泛應(yīng)用的單次使用收集技術(shù)是深層過濾。不過，生物量濃度較高的情況下，深層過濾器在負(fù)載量較低時(shí)就會(huì)堵塞。較高的污染物濃度也讓深層過濾器對(duì)批次變異更為敏感，因此為了彌補(bǔ)過濾能力的波動(dòng)， 過濾器的面積會(huì)過大（ 多達(dá)50%）。目前可以使用離心之類的單次使用細(xì)胞去除方案，但是生產(chǎn)能力較低，導(dǎo)致成本較高，浪費(fèi)較大。
不過，一種新替代方案已經(jīng)出現(xiàn)。賽多利斯斯泰迪生物技術(shù)公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術(shù)，用于高細(xì)胞密度的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的收集。這種即用型的澄清系統(tǒng)得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā)，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎(chǔ)，該系統(tǒng)性能穩(wěn)定、易于使用、快速、可以靈活地放大。
該系統(tǒng)可以處理高達(dá)2,000 L 的體積，因此能夠在一個(gè)步驟之內(nèi)同時(shí)替代離心機(jī)和深層過濾器。關(guān)鍵因素在于進(jìn)料流中添加了高孔隙度的助濾劑，增加了濾餅的滲透性，防止過濾器出現(xiàn)堵塞。
摻漿過濾
很長(zhǎng)時(shí)間以來， 摻漿過濾中運(yùn)用硅藻土（DE）之類的助濾劑來提升過濾器的性能。[3] 硅藻土（DE， 或稱為diatomite 、kieselgur/kieselguhr） 是一種天然存在的硅質(zhì)沉積巖，質(zhì)軟，通常粒徑為10-200 μm。DE 是由硅藻（微小的單細(xì)胞藻類）化石的殼或外骨骼構(gòu)成，具有高孔隙率的結(jié)構(gòu)和惰性特征，通常在生物技術(shù)行業(yè)的收集階段用于深層過濾器。加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中的DE 具有雙重作用：濾除亞微米的顆粒，并形成一個(gè)具有滲透性的濾餅，改善過濾器的處理量。這種細(xì)小的助濾劑顆粒形成無數(shù)微小通道，懸浮的雜質(zhì)被截留，而澄清的液體可以不受阻礙地通過。
BFF 的工作原理
現(xiàn)在有眾多產(chǎn)品的生產(chǎn)運(yùn)用了BFF 系統(tǒng)，其中包括靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）、白蛋白和一些*，所基于的原理包括選擇性pH 誘導(dǎo)沉淀、離子強(qiáng)度、添加乙醇以及溫度的變化。[4-6] 沉淀物的去除采用的是DE 強(qiáng)化的深層過濾。
實(shí)際操作過程中，需要進(jìn)行澄清操作的生物工藝流體中固體的濃度過高時(shí)，流體將不能透過過濾器表面的濾餅（圖1）。添加DE 之類的助濾劑之后，形成的濾餅更具滲透性，可以防止堵塞。所需DE 的量取決于顆粒的濃度。為了獲得理想的結(jié)果并使用盡可能少的DE，建議對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)處理?？梢蕴砑幽蹌┗蛘呖梢越档?/span>pH 值，從而形成聚集體，其體積大至不能進(jìn)入濾餅層。這樣，濾餅可以保持滲透性，而DE 與生物量的比例可以降低為1:4。
賽多利斯斯泰迪生物技術(shù)公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術(shù)，用于高細(xì)胞密度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的收集，該技術(shù)得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā)，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎(chǔ)。（圖片有賽多利斯公司提供）圖1：加入硅藻土（左）的動(dòng)態(tài)摻漿過濾和常規(guī)的過濾（右）。
DE 有各種級(jí)別，純度和滲透性各異，適合不同的應(yīng)用，而賽多利斯斯泰迪生物技術(shù)公司選擇了Celpure C300 作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)操作中最合適的助濾劑。
Celpure C300 特別針對(duì)制藥領(lǐng)域設(shè)計(jì)，采用生產(chǎn)工藝制造，是一種高純度的DE，具有更出色的操作穩(wěn)定性。在多種培養(yǎng)基、介質(zhì)和活力條件下進(jìn)行的測(cè)試發(fā)現(xiàn)，的DE 濃度為細(xì)胞濕重（WCW）的40-50%，如果pH 降低至5，這一比例還可以減小至20-30%。
低pH 值沉淀的優(yōu)勢(shì)
對(duì)于微孔過濾和深層過濾之類的細(xì)胞去除技術(shù)，性能的差異可以歸結(jié)于低pH 值水平（pH 4.3-5.5）下較小顆粒的沉降。[4-5] 細(xì)胞碎片、DNA 以及宿主細(xì)胞蛋白在酸性條件下的溶解性都會(huì)降低。6 另外，降低pH 值之后可以形成較大的顆粒，原來在pH 7.0 時(shí)存在的亞微顆粒會(huì)*消失（圖2）。與此類似，較低的pH 值也有利于BFF 的操作：所測(cè)試的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在酸性條件下時(shí)，濾出液比中性條件時(shí)更為澄清（未顯示數(shù)據(jù)）。
圖2：三種不同的收集方式（綠色=pH 7.0，紅色=pH 5.0，）下，不含細(xì)胞的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞培養(yǎng)上清液的平均粒徑分布。利用Mastersizer 2000（Malvern Instruments 公司）記錄數(shù)據(jù)。
人們認(rèn)為，DE 可以捕獲大顆粒（>0.4μm），因此總體的滲透性和過濾能力會(huì)降低。通過增加DE 的濃度，有可能改善其性能，截留小顆粒，同時(shí)不會(huì)喪失所需的濾餅滲透性。另外，雖然大部分抗體在酸性條件下是穩(wěn)定的，但是有一些抗體可能會(huì)出現(xiàn)共沉淀。[5-6] 實(shí)驗(yàn)室的BFF 測(cè)試在低pH 值條件時(shí)，可以獲得85% 以上的回收率（未顯示數(shù)據(jù)）。
實(shí)際應(yīng)用
細(xì)胞培養(yǎng)收集過程中BFF 已經(jīng)作為一種替代方法得到廣泛應(yīng)用，因此賽多利斯斯泰迪生物技術(shù)公司與RentschlerBiotechnologie 公司合作，評(píng)估這種技術(shù)作為單次使用技術(shù)，替代離心機(jī)和深層過濾器的可能性。[7] 測(cè)試中采用了600 L 的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)過程，對(duì)條件進(jìn)行了優(yōu)化，評(píng)估了BFF 技術(shù)的升級(jí)放大。
Sartoclear Dynamics 是專門針對(duì)藥品生產(chǎn)過程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的澄清操作而設(shè)計(jì)的產(chǎn)品，利用這種設(shè)備在一系列細(xì)胞株和培養(yǎng)介質(zhì)中獲得了測(cè)試結(jié)果。
運(yùn)用高細(xì)胞密度的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO） 細(xì)胞分批補(bǔ)料式培養(yǎng)（17.6×106 cells/mL，95% 的活力，1000L），進(jìn)行了試驗(yàn)生產(chǎn)測(cè)試。[8] 的BFF 測(cè)試為600 L，pH 5.0（WCW = 8%）。在放大試驗(yàn)中，在通用型不銹鋼支架中使用了總過濾面積為1.61 m2的七個(gè)工藝放大模塊。
過濾器的過濾盒由兩層聚乙烯過濾板組成，中間為DE 和生物量。600L的收集液中加入Cellpure C300 DE（12kg），預(yù)填充DE 袋通過無塵適配器與混合袋連接，迅速安全地轉(zhuǎn)移DE。溫和混勻5 分鐘之后，DE 的粉末溶于細(xì)胞懸浮液中；另外，在過濾前，對(duì)所獲得的混合物調(diào)節(jié)pH 至5.0，以140 rpm 的速度混合2 小時(shí)。
圖3 所示為操作過程中的壓力增加情況。當(dāng)壓力值達(dá)到1.3 bar 時(shí)，過濾過程結(jié)束，初始收集液已經(jīng)過濾。在整個(gè)過程中保持了大約為300 L/m2/h 的快速且穩(wěn)定的流速，并且總體的處理能力達(dá)到了311L/m2。在過濾過程中，澄清的收集液流具有很低的濁度水平（5–8 NTU）。中和之后，最終的液體具有41 NTU 的濁度，這個(gè)數(shù)值相當(dāng)高，可能的原因在于未能充分調(diào)節(jié)中和緩沖液的用量。
在一項(xiàng)小規(guī)模的平行測(cè)試中，改良中和步驟之后可以防止?jié)岫鹊脑黾?。正在開發(fā)的一種即用型整合工藝模塊，可以讓pH 值的在線調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)可控。例如，IgG1 的回收率目前為85%（圖3），今后，通過優(yōu)化中和步驟，改進(jìn)過濾后沖洗，mAb 的回收率將有望進(jìn)一步得到提升。在整個(gè)工藝過程內(nèi)對(duì)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA 之類的污染物進(jìn)行了監(jiān)控，在最終的液體內(nèi)（緩沖液沖洗以及中和之后），這些污染物的濃度分別從841 和13.8 mg/ml 降低至629 和5.0 mg/ml。
圖3：七個(gè)過濾器模塊中，降低pH（5.0）的情況下DE 摻漿過濾試驗(yàn)放大的結(jié)果。左：過濾性能、壓力（bar）、流量（L/m2）以及過濾過程中的濁度。右：IgG1 的回收，在初始收集液、無緩沖沖洗的收集液（液1）、有緩沖沖洗（液2）以及中和之后的收集液（液3）中進(jìn)行測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
BFF 的試運(yùn)行試驗(yàn)證實(shí)了此前實(shí)驗(yàn)室中觀察到的結(jié)果：DE 加入到初始的細(xì)胞培養(yǎng)上清液之后，將pH 降低至5.0，這樣的條件之下在過濾性能、沖洗和污染物去除方面可以獲得的結(jié)果。此外，只需運(yùn)用七個(gè)過濾模塊，就可以在1 小時(shí)之內(nèi)對(duì)600L 的收集液進(jìn)行處理。因?yàn)槟K座可以容納多達(dá)33 個(gè)的模塊，可以預(yù)計(jì)，高達(dá)3,000L 的收集體積可以同時(shí)進(jìn)行過濾。因此，運(yùn)用這樣的方法，在單次使用的大規(guī)模裝置內(nèi)，可以對(duì)初始的高密度細(xì)胞培養(yǎng)收集液實(shí)現(xiàn)高效的澄清操作。
總結(jié)
測(cè)試的目的是為了證實(shí)一種新穎的單次使用收集方法，對(duì)于高密度的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)具有普遍的適用性，測(cè)試中采用了不同的細(xì)胞株和培養(yǎng)條件下的初始收集液，確定了DE 作為助濾劑的濃度。此外，在低pH 條件下，發(fā)現(xiàn)助濾劑的量可以減少50%。
與沉淀過程結(jié)合使用時(shí)，研究中的單次使用澄清系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，無需再使用離心機(jī)，其結(jié)果穩(wěn)定一致，該系統(tǒng)易于操作、快速、可以在線放大，可以將兩步驟的細(xì)胞收集操作轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝У膯尾襟E操作，節(jié)約了時(shí)間和資金。
BFF 等類似可以實(shí)現(xiàn)放大的技術(shù)彌補(bǔ)了單次使用產(chǎn)品市場(chǎng)中的空白之一。當(dāng)前單次使用生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)體積設(shè)定為2000 L，如此龐大的體積，不再需要離心機(jī)來去除細(xì)胞，這對(duì)于生物制藥行業(yè)而言是巨大的技術(shù)進(jìn)步，構(gòu)建了一個(gè)真正的單次使用過程，帶來了的靈活性，顯著地降低了資金投入。Sartoclear Dynamics 這種產(chǎn)品特別針對(duì)cGMP 工藝設(shè)計(jì)，由單次使用預(yù)填充袋組成，其中含有超純級(jí)別的硅藻土，可以在0.5-10 kg 的范圍內(nèi)選擇。無塵粉末轉(zhuǎn)移裝置配備有快速連接適配器，DE可以直接與細(xì)胞培養(yǎng)液混合。這種多孔的助濾劑可以防止過濾器堵塞，另外因?yàn)樵撓到y(tǒng)內(nèi)生物量和助濾劑一直保持穩(wěn)定的比例，過濾器的性能則可以連續(xù)穩(wěn)定且達(dá)到狀態(tài)，用戶因此受益。BFF能夠以高流速對(duì)非常稠密的初始細(xì)胞收集液進(jìn)行澄清操作，因此具有經(jīng)濟(jì)效益并且提升了生產(chǎn)力。
