產(chǎn)品信息
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 |
GMP-M062-01A | Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade | 500U |
GMP-M072-01A | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade | 2500U |
GMP -S062 | SAM (32mM), GMP Grade | 0.5ml |
M062-YH01-01A | Vaccinia Capping System | 500U |
M072 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase | 2500U/2500U×5 |
產(chǎn)品簡介
Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基，在高等真核細(xì)胞中，該甲基化是天然加帽過程的一部分，Cap 1 結(jié)構(gòu)提高了 mRNA 的翻譯效率。mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase 能在 RNA 5′末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團，利用 S-腺苷硫氨酸（SAM）作為甲基供體，使帶帽 Cap 0 甲基化為 Cap 1。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會作用于 5′末端為 pN、ppN、pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 可通過近岸蛋白質(zhì) Vaccinia Capping System（貨號: M062）獲得。
圖1. mRNA 帽結(jié)構(gòu) 2′ -O-甲基轉(zhuǎn)移酶作用機理。mRNA 的帽結(jié)構(gòu)是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0 結(jié)構(gòu)由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應(yīng)形成。進一步形成 cap-1 結(jié)構(gòu)需要 2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的參與，該修飾可以降低 RNA 在體內(nèi)引起的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。本圖引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65.
本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應(yīng)，使加帽反應(yīng)在 1h 之內(nèi)完成，效率接近 100%。IVT 推薦使用近岸蛋白質(zhì) T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號：E131）。
產(chǎn)品用途：
提高RNA的翻譯效率；
改善mRNA在顯微注射和轉(zhuǎn)染后的表達(dá)。
注意事項：
SAM：需事先計算好 SAM 的用量，在反應(yīng)開始前把分裝的 32 mM 的儲備液稀釋成2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。
Cap 0-RNA 的制備：IVT RNA 需進行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA 溶液或其他鹽溶液中。Cap 0-RNA 可通過近岸蛋白質(zhì) Vaccinia Capping System（貨號：M062）反應(yīng)體系獲得。為減少反應(yīng)步驟，也可通過在同一體系內(nèi)添加兩種酶直接獲得 Cap1-RNA，該反應(yīng)基于近岸蛋白質(zhì) Cap 1 Capping System（貨號：M082），試劑盒內(nèi)涵蓋 Vaccinia Capping System和 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase。
RNA 二級結(jié)構(gòu)：一些 RNA 轉(zhuǎn)錄本可能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)（同源二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)），如二級結(jié)構(gòu)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄本的 5'端會影響加帽效率。在與加帽酶反應(yīng)之前加熱 RNA 可以去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5′端的二級結(jié)構(gòu)，如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時間延長至 10min。
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質(zhì) E. coli Poly(A) Polymerase（貨號：M012）進行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進行 RNA 轉(zhuǎn)染實驗前做純化處理。
RNase Inhibitor：在配置反應(yīng)體系時，可以加入 0.5 µl 近岸蛋白質(zhì) RNase 抑制劑（貨號：E125），同時去掉等體積的 RNase-free 水。
相關(guān)產(chǎn)品：
For research and manufacturing use only.
