蛋白質(zhì)提取方法
在0.2 ml均質(zhì)緩沖液(0.1 M EDTA, 0.12 M Tris-HCl, pH6.8, 4% SDS, 10%甘油，10%2-qiujiyichun )中提取大約100 mg的植物材料，在1.5ml Eppendorf管中提取雌蕊和少量的沙。再加入0.8 ml緩沖液，將提取液充分混合。碎片在14000 rpm的轉(zhuǎn)速下被離心成球。上清液與2x SDS上樣緩沖液混合，95℃煮沸10min。(未檢測(cè)到BAK1帶)
將大約200mg的植物材料在含有液氮的砂漿中研磨，并收集到2.0 mL的微管中。加入2x SDS上樣緩沖液0.2 ml (0.125M Tris-HCl (pH 6.8)， 10% 2-qiujiyichun，4% SDS, 10%蔗糖，0.004% BPB)，渦旋混合2min, 95℃煮沸10min。碎片在14000 rpm的轉(zhuǎn)速下被離心成球。收集上清液。(BAK1樂隊(duì)可視化)
免疫印跡法
用10% SDS-PAGE分離30 μ l，使用Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad)將其印跡7min至Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer pack。用4%的牛奶在TBS-T中攪拌1h/RT阻斷印跡。將印跡用稀釋1:20 00的一抗在4%的牛奶中孵育，在TBS-T中攪拌1h/RT。將抗體溶液倒出，在TBS-T中攪拌，在RT下洗滌3次，5min。用山羊抗兔IgG (H&L)， HRP標(biāo)記(AS09 602 Agrisera)，攪拌1:2000 1h/RT孵育印跡。印跡在TBS-T中RT攪拌洗滌3次，15分鐘，并用AgriseraECL超亮顯影5分鐘。曝光時(shí)間為1min。
