間隙連接是由連接蛋白構(gòu)成的專門的細(xì)胞間膜通道，可選擇性促進(jìn)<1.5 kD的小分子通過細(xì)胞。它們受電壓，生長因子，cAMP的緊密調(diào)節(jié)，并且受磷酸化調(diào)節(jié)。Cell Meter™熒光細(xì)胞間隙連接檢測試劑盒為體外測定間隙連接功能提供了可靠而強(qiáng)大的檢測方法。該方法是非侵入性的。對研究中的細(xì)胞群進(jìn)行劃分，以使其中一小部分載有親脂性細(xì)胞質(zhì)膜可滲透染料Calcein UltraGreen™AM，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)酯酶吸收細(xì)胞時，該染料會水解，從而生成Calcein UltraGreen（一種高度熒光且保留良好的膜） -不可滲透的分子。另一部分是DiD，它是一種親脂性膜染料，在摻入膜時會橫向擴(kuò)散，使整個細(xì)胞膜染成深紅色熒光。將兩個部分混合并在共培養(yǎng)條件下孵育。鈣黃綠素UltraGreen通過間隙連接轉(zhuǎn)移到DiD染色的細(xì)胞中?？梢酝ㄟ^熒光成像或流式細(xì)胞術(shù)檢測。百螢生物為您提供優(yōu)質(zhì)的Cell Meter™熒光細(xì)胞間隙連接檢測試劑盒。
適用儀器
| 流式細(xì)胞儀 | |
| 激發(fā)： | 488 nm and 640 nm激光 |
| 發(fā)射： | 530/30 nm and 660/20 nm濾波片 |
| 通道： | FITC和APC通道 |
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā)： | FITC和Cy5濾波片組 |
| 發(fā)射： | FITC和Cy5濾波片組 |
| 推薦孔板： | 黑色透明 |
樣品分析方案
概述
將鈣黃綠素Ultragreen AM工作溶液添加到細(xì)胞中
將DiD工作溶液添加到細(xì)胞中
在37°C下孵育10-30分鐘
用GAP連接檢測緩沖液洗滌細(xì)胞
將細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中并按1：1比例混合
使用帶有530/30 nm和660/20 nm發(fā)射濾光片的流式細(xì)胞儀或帶有FITC和Cy5濾光片組的熒光顯微鏡在不同時間檢測熒光信號
儲備溶液配制
注意：將未使用的Calcein Ultragreen AM儲備溶液分裝在-20°C下，一次性使用，以免凍融循環(huán)。
注意：一個樣品瓶足以進(jìn)行50次測試。
注意：將未使用的DiD儲備溶液分裝在-20°C下，以單次使用，以免凍融循環(huán)。
注意：不宜儲存Calcein Ultragreen AM工作溶液，應(yīng)立即使用。
注意：1 mL Calcein Ultragreen AM工作溶液足以進(jìn)行兩次測試。
注意：DiD工作溶液不宜存儲，應(yīng)立即使用。
注意：1 mL DiD工作溶液足以進(jìn)行兩次測試。
操作步驟
在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
除去細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL鈣黃綠素Ultragreen AM工作溶液。
在37°C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。
注意：應(yīng)為每個細(xì)胞系優(yōu)化孵育時間。除去染料工作溶液，并用GAP連接分析緩沖液洗滌細(xì)胞。
注意：對于貼壁細(xì)胞，請使用細(xì)胞橡膠刮板將細(xì)胞從板上分離下來。在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。
在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
除去細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入0.5 mL DiD工作溶液。
在37°C下孵育細(xì)胞10-20分鐘。
注意：應(yīng)為每個細(xì)胞系優(yōu)化孵育時間。除去染料工作溶液，并用GAP連接分析緩沖液洗滌細(xì)胞。
注意：對于貼壁細(xì)胞，請使用細(xì)胞橡膠刮板將細(xì)胞從板上分離下來。在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞。
將鈣黃綠素染色的細(xì)胞和DiD標(biāo)記的細(xì)胞以1：1的比例混合，并鋪在孔中。
注意：對于熒光顯微鏡，將每個50 µL加到96孔板的孔中并混合均勻。
注意：對于流式細(xì)胞儀，將每一種加入500 µL到6孔板的孔中并混合均勻。在37°C下孵育細(xì)胞2-3小時。
使用FITC和Cy5濾光片組通過熒光顯微鏡檢測細(xì)胞。
對于流式細(xì)胞儀分析：對于貼壁細(xì)胞，使用細(xì)胞橡膠刮板分離細(xì)胞。一旦細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)或?qū)τ趹腋〖?xì)胞，請用DPBS或您選擇的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于HHBS（#20011）或DPBS或您選擇的緩沖液中，并使用530/30 nm濾光片（FITC通道）和660/20 nm濾光片（APC通道）檢測。
