【詳細說明】
蛋白質的定量測定(一)-- 凱氏定氮法
目的要求
(1)學習微量凱氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凱氏定氮法的操作方法。
實驗原理
生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義,如蛋白質的含氮量約為16%,測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定,通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測定準確度高,可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點,因而被為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。其原理如下:
1. 消化:有機物與濃硫酸供熱,使有機氮全部轉化為無機氮——硫酸銨。為加快反應,添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物;前者為催化劑,后者可提高硫酸沸點。這一步約需30min至1h,視樣品的性質而定。
2. 加堿蒸餾:硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH, 加熱后生成NH3, 通過蒸餾導入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定:用過量標準HCl吸收NH3,剩余的酸可用標準NaOH滴定,由所用HCl摩爾數(shù)減去滴定耗去的NaOH摩爾數(shù),即為被吸收的NH3摩爾數(shù)。此法為回滴法,采用甲基紅衛(wèi)指示劑。HCl+NaOHNaCl +H2O
本法適用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量測定。
1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5.玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼 9. 夾子 10. 反應室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網(wǎng)
圖3.4 微量凱氏蒸餾裝置示意圖
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸;30%;10 M氫氧化鈉;0.01M的標準鹽酸;標準硫酸銨(0.3mg氮/mL)。
催化劑:硫酸銅:硫酸鉀=1:4混合,研細。
指示劑:0.1%甲基紅乙醇溶液。
二、測試樣品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凱氏定氮儀;移液管1mL(×3);2mL(×1);微量滴定管5mL(×1); 燒杯200mL(×2);量筒10mL(×1);三角燒瓶150mL(×4);凱氏燒瓶50mL(×4),吸耳球(×1);電爐;分析天平。
操作方法
一、樣品處理
稱取牛血清白蛋白50mg,加入2個凱氏燒瓶中,另2個凱氏燒瓶為空白對照,不加樣品。分別在每個凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加5 mL濃硫酸。
二、消化
將以上4個凱氏燒瓶置于通風櫥中電爐上加熱。在消化開始時應控制火力,不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完,硫酸開始分解并放出SO2白煙后,適當加強火力,繼續(xù)消化,使瓶內液體微微沸騰,大約維持2 ~ 3h。待消化液變成褐色后,為了加速完成消化,可將燒瓶取下,稍冷,將30%1 ~ 2滴加到燒瓶底部消化液中,再繼續(xù)消化,直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色,消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中,并以蒸餾水洗滌燒瓶數(shù)次,將洗液并入容量瓶中,定容備用。
三、蒸餾
1. 蒸餾器的洗滌
蒸氣發(fā)生器中盛有加有數(shù)滴H2SO4的蒸餾水和數(shù)粒沸石。加熱后,產生的蒸汽經(jīng)貯液管、反應室至冷凝管,冷凝液體流入接受瓶。每次使用前,需用蒸汽洗滌10分鐘左右(此時可用一小燒杯承接冷凝水)。將一只盛有5mL 2%硼酸液和1 ~ 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端,使冷凝管管口插入液體中,繼續(xù)蒸餾1 ~ 2分鐘,如硼酸液顏色不變,表明儀器已洗凈。
2. 消化樣品及空白的蒸餾
取50mL 錐形瓶數(shù)個,各加25mL 0.01M標準HCl和1 ~ 2滴指示劑,用表面皿覆蓋備用。
取2mL 稀釋消化液,由小漏斗加入反應室。將一個裝有0.01M標準HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下,使冷凝器管口下端浸沒在液體內。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液,倒入小漏斗,讓NaOH溶液緩慢流入反應室。尚未盡時,加緊夾子,向小漏斗加入約5mL蒸餾水,同樣緩緩放入反應室,并留少量水在漏斗內作水封。加熱水蒸氣發(fā)生器,沸騰后,關閉收集器活塞。使蒸汽沖入蒸餾瓶內,反應生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸餾,移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm,并用少量蒸餾水冷凝管口。取下錐形瓶,以0.01M NaOH標準溶液滴定。記下所耗去的體積。
3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌
蒸餾完畢后,移取熱源,夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管,此時由于收集器溫度突然下降,即可將反應室殘液吸至收集器。
- 標準樣品的測定
在蒸餾樣品及空白前,為了練習蒸餾和滴定操作,可用標準硫酸銨試做實驗2 ~ 3次。
標準硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL,每次實驗取2.0mL。
四、計算
樣品的含氮量(mg/mL)=
若測定的蛋白質含氮部分只是蛋白質(如血清),則:
樣品中蛋白質含量(mg/mL)=
式中:A為滴定空白用去的NaOH平均mL數(shù),B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數(shù),V為樣品的mL數(shù),0.01 NaOH的摩爾濃度,14為氮的原子量,6.25為系數(shù)(蛋白質的平均含氮量為16%,由凱氏定氮法測出含氮量,再乘以系數(shù)6.25即為蛋白質量),N為樣品的稀釋倍數(shù)。
注意事項
(1)必須仔細檢查凱氏定氮儀的各個連接處,保證不漏氣。
(2)凱氏定氮儀必須事先反復清洗,保證潔凈。
(3)小心加樣,切勿使樣品沾污口部、頸部。
(4)消化時,須斜放凱氏燒瓶(45o左右)。火力先小后大,避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。
(5)蒸餾時,小心加入消化液。加樣時將火力擰小或撤去。蒸餾時,切記火力不穩(wěn),否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。
(6)蒸餾后應及時清洗定氮儀。
【詳細說明】
蛋白質的定量測定(一)-- 凱氏定氮法
目的要求
(1)學習微量凱氏定氮法的原理。
(2)掌握微量凱氏定氮法的操作方法。
實驗原理
生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義,如蛋白質的含氮量約為16%,測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定,通常采用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由于具有測定準確度高,可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點,因而被為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。其原理如下:
1. 消化:有機物與濃硫酸供熱,使有機氮全部轉化為無機氮——硫酸銨。為加快反應,添加硫酸銅和硫酸鉀的混合物;前者為催化劑,后者可提高硫酸沸點。這一步約需30min至1h,視樣品的性質而定。
2. 加堿蒸餾:硫酸銨與NaOH(濃)作用生成(NH4)OH, 加熱后生成NH3, 通過蒸餾導入過量酸中和生成NH4Cl而被吸收。
3. 滴定:用過量標準HCl吸收NH3,剩余的酸可用標準NaOH滴定,由所用HCl摩爾數(shù)減去滴定耗去的NaOH摩爾數(shù),即為被吸收的NH3摩爾數(shù)。此法為回滴法,采用甲基紅衛(wèi)指示劑。HCl+NaOHNaCl +H2O
本法適用于0.2 ~ 2.0 mg的氮量測定。
1.熱源 2. 燒瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5.玻璃杯 6. 棒狀玻塞 7. 反應室 8. 反應室外殼 9. 夾子 10. 反應室中插管 11. 冷凝管 12. 錐形瓶 13. 石棉網(wǎng)
圖3.4 微量凱氏蒸餾裝置示意圖
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸;30%;10 M氫氧化鈉;0.01M的標準鹽酸;標準硫酸銨(0.3mg氮/mL)。
催化劑:硫酸銅:硫酸鉀=1:4混合,研細。
指示劑:0.1%甲基紅乙醇溶液。
二、測試樣品
牛血清白蛋白。
三、器材
微量凱氏定氮儀;移液管1mL(×3);2mL(×1);微量滴定管5mL(×1); 燒杯200mL(×2);量筒10mL(×1);三角燒瓶150mL(×4);凱氏燒瓶50mL(×4),吸耳球(×1);電爐;分析天平。
操作方法
一、樣品處理
稱取牛血清白蛋白50mg,加入2個凱氏燒瓶中,另2個凱氏燒瓶為空白對照,不加樣品。分別在每個凱氏燒瓶中加入約500mg硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加5 mL濃硫酸。
二、消化
將以上4個凱氏燒瓶置于通風櫥中電爐上加熱。在消化開始時應控制火力,不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完,硫酸開始分解并放出SO2白煙后,適當加強火力,繼續(xù)消化,使瓶內液體微微沸騰,大約維持2 ~ 3h。待消化液變成褐色后,為了加速完成消化,可將燒瓶取下,稍冷,將30%1 ~ 2滴加到燒瓶底部消化液中,再繼續(xù)消化,直到消化液由淡黃色變成透明淡藍綠色,消化即告完成。冷卻后將瓶中的消化液倒入50mL容量瓶中,并以蒸餾水洗滌燒瓶數(shù)次,將洗液并入容量瓶中,定容備用。
三、蒸餾
1. 蒸餾器的洗滌
蒸氣發(fā)生器中盛有加有數(shù)滴H2SO4的蒸餾水和數(shù)粒沸石。加熱后,產生的蒸汽經(jīng)貯液管、反應室至冷凝管,冷凝液體流入接受瓶。每次使用前,需用蒸汽洗滌10分鐘左右(此時可用一小燒杯承接冷凝水)。將一只盛有5mL 2%硼酸液和1 ~ 2滴指示劑的錐形瓶置于冷凝管下端,使冷凝管管口插入液體中,繼續(xù)蒸餾1 ~ 2分鐘,如硼酸液顏色不變,表明儀器已洗凈。
2. 消化樣品及空白的蒸餾
取50mL 錐形瓶數(shù)個,各加25mL 0.01M標準HCl和1 ~ 2滴指示劑,用表面皿覆蓋備用。
取2mL 稀釋消化液,由小漏斗加入反應室。將一個裝有0.01M標準HCl和指示劑的錐形瓶放在冷凝管下,使冷凝器管口下端浸沒在液體內。
用小量筒量取5mL 10M NaOH溶液,倒入小漏斗,讓NaOH溶液緩慢流入反應室。尚未盡時,加緊夾子,向小漏斗加入約5mL蒸餾水,同樣緩緩放入反應室,并留少量水在漏斗內作水封。加熱水蒸氣發(fā)生器,沸騰后,關閉收集器活塞。使蒸汽沖入蒸餾瓶內,反應生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸餾,移動錐形瓶使液面離開冷凝管口約1cm,并用少量蒸餾水冷凝管口。取下錐形瓶,以0.01M NaOH標準溶液滴定。記下所耗去的體積。
3. 蒸餾后蒸餾器的洗滌
蒸餾完畢后,移取熱源,夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管,此時由于收集器溫度突然下降,即可將反應室殘液吸至收集器。
- 標準樣品的測定
在蒸餾樣品及空白前,為了練習蒸餾和滴定操作,可用標準硫酸銨試做實驗2 ~ 3次。
標準硫酸銨的含氮量是0.3mg/mL,每次實驗取2.0mL。
四、計算
樣品的含氮量(mg/mL)=
若測定的蛋白質含氮部分只是蛋白質(如血清),則:
樣品中蛋白質含量(mg/mL)=
式中:A為滴定空白用去的NaOH平均mL數(shù),B為滴定樣品用去的NaOH平均mL數(shù),V為樣品的mL數(shù),0.01 NaOH的摩爾濃度,14為氮的原子量,6.25為系數(shù)(蛋白質的平均含氮量為16%,由凱氏定氮法測出含氮量,再乘以系數(shù)6.25即為蛋白質量),N為樣品的稀釋倍數(shù)。
注意事項
(1)必須仔細檢查凱氏定氮儀的各個連接處,保證不漏氣。
(2)凱氏定氮儀必須事先反復清洗,保證潔凈。
(3)小心加樣,切勿使樣品沾污口部、頸部。
(4)消化時,須斜放凱氏燒瓶(45o左右)?;鹆ο刃『蟠?,避免黑色消化物濺到瓶口、瓶頸壁上。
(5)蒸餾時,小心加入消化液。加樣時將火力擰小或撤去。蒸餾時,切記火力不穩(wěn),否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。
(6)蒸餾后應及時清洗定氮儀。