RT-PCR技術(shù)服務(wù)的核心步驟包括:
RNA提?。簭慕M織或細(xì)胞等樣本中提取RNA,確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。
反轉(zhuǎn)錄(RT):在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以RNA為模板合成cDNA的第一鏈。這一步驟通常使用隨機(jī)引物、Oligo dT或基因特異性引物中的一種。
PCR擴(kuò)增:以cDNA為模板,在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到目的片段。
RT-PCR技術(shù)服務(wù)的注意事項(xiàng):
避免RNA酶污染:RNA酶會(huì)降解RNA,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,在操作過(guò)程中應(yīng)使用RNA酶抑制劑,并確保所有器皿和試劑無(wú)RNA酶污染。
選擇合適的引物:引物的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇合適的引物,如隨機(jī)引物、Oligo dT或基因特異性引物。
控制反應(yīng)條件:不同來(lái)源的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度有所不同,應(yīng)根據(jù)所選逆轉(zhuǎn)錄酶的要求設(shè)置合適的反應(yīng)條件。
RT-PCR技術(shù)服務(wù)的應(yīng)用:
基因表達(dá)研究:通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中特定基因mRNA的含量,可以評(píng)估該基因的表達(dá)水平。
病毒檢測(cè):RT-PCR技術(shù)可用于檢測(cè)細(xì)胞中的RNA病毒,如SARS-CoV-2等。
基因克隆:通過(guò)RT-PCR技術(shù)可以直接克隆特定基因的cDNA序列,為后續(xù)的基因功能研究提供基礎(chǔ)