肌酸激酶(CK)試劑盒
肌酸激酶(CK)試劑盒
本試劑盒僅供科研使用 1 肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) (貨號(hào):WS5580F 紫外分光法 48 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: 肌酸激酶(CK,EC 2.7.3.2)主要存在于心臟、肌肉及腦等組織中,能可逆地催化 肌酸與 ATP 之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng),在能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和 ATP 再生中有重要作用。 CK 催化磷酸肌酸和 ADP 生成肌酸和 ATP,通過(guò)添加的己糖激酶與 6-磷酸葡萄糖 脫氫酶復(fù)合體,依次催化 ATP 的水解與并伴隨著 NADPH 的生成,通過(guò)檢測(cè) NADPH 在 340nm 處吸光值的增加即可得出 CK 酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下,使粉劑落到底部, 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑二 粉劑×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下,使粉劑落到底部, 再加 1.1mL 蒸餾水充分溶解。 試劑三 液體 16mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑×4 支 4℃保存 臨用前甩幾下,使粉劑落到底部, 每支加 0.3mL 蒸餾水充分溶解。 三、所需的儀器和用品: 紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿(光徑 1cm)、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、恒 溫培養(yǎng)箱、研缽。 四、肌酸激酶(CK)活性測(cè)定: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿,轉(zhuǎn)移至 EP 管中,12000rpm, 4℃ 離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液(mL)為 1:5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本:直接檢測(cè);若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè): ① 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱 30min,設(shè)定溫度至 37℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm,蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑可預(yù)先在 37℃條件下預(yù)溫 5min。 ③ 在 1mL 石英比色皿中依次加入: 試劑名稱(μL) 測(cè)定管 樣本 80本試劑盒僅供科研使用 2 【注】1.若 A 測(cè)定大于 1.5,則可減少反應(yīng)時(shí)間 T(如減至 10min)再讀取 A2,或減少樣本加樣量 V1 (如減至 40μL, 則試劑三相應(yīng)增加),則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2.若△A 的值小于 0.01,則可增大樣本體積 V1(如增至 160μL 或更多,則試劑三相應(yīng)減少), 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T(如增至 30min 或更長(zhǎng)),則改變后的 T 和 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按組織蛋白含量計(jì)算: 定義:37℃條件下,每毫克蛋白質(zhì)在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=93.8×ΔA÷Cpr 2、按組織樣本質(zhì)量計(jì)算: 定義:37℃條件下,每克樣品在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1÷V×W)÷T=93.8×ΔA÷W 3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算: 定義:37℃條件下,每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.19×ΔA 4、按血清計(jì)算: 定義:37℃條件下,每毫升液體在每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生 1nmoLNADPH 為一個(gè)酶活單位。 CK 活性(nmoL/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=93.8×ΔA V---加入提取液體積,1 mL; V1---加入樣本體積,0.08mL; V2---反應(yīng)體系總體積,7×10-4 L; d---光徑,1cm; ε---NADPH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/moL/cm; W---樣本質(zhì)量,g; T---反應(yīng)時(shí)間,15min; Cpr---蛋白濃度(mg/mL),建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。 試劑一 20 試劑二 20 試劑三 560 37℃條件下孵育 20min, 試劑四 20 混勻,37℃條件下,立即于 340nm 處讀取 A1,15min 后讀取 A2,△A= A2-A1。