人乙肝表面抗原（HbsAg）ELISA試劑盒
完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： 3.1 免疫吸附劑 3.2 結(jié)合物 3.3 酶的底物 3.4 洗滌液 3.5 酶反應(yīng)終止液 3.6 陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品 3.7 參考標(biāo)準(zhǔn)品
（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定
中）；
（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應(yīng)終止液。
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。有些
不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測(cè)人員需自行包被。以下簡(jiǎn)述固相載體和包
被過(guò)程。
固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺?/span>ELISA中載
體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋
白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚
苯乙烯為塑料，可制成各種形式。
ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常
用，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便
于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板
相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出
結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保
溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是
對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接
法測(cè)抗體時(shí)空白值較大。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各
孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差
別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。
常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每
孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分
別測(cè)每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的
平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。
與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板
薄，可剪割，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋
白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測(cè)定
方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體
上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)
果差別zui大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目的zui合適的固相載體。
在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附
面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板
孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧
度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于*反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式
ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器，
使小珠在洗滌過(guò)程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難
度較大，小珠的均一性較差。
小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠
式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增
加有助于試驗(yàn)敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，zui后直接放入分光光度計(jì)中比
色。
也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面
積*，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相
載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。
將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被（coating）。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固
相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分
子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性
的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同
的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表
面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露
于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方
法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原
決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，
即先將針對(duì)該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)
合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相
抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采
用捕獲包被法（見(jiàn)2.2.4），試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包
被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體
上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測(cè)抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包
被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射
（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白
質(zhì)，如聚賴氨酸、*等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素*系
統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入*化的DNA，這種包被方法均勻、
牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。
脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA
板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐?/span>
磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式。
用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三
大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如
HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白
成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?。重組抗原
是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的
優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌
為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽(yáng)性，
因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能
用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不
能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCV ELISA中所用包被
抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原
如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分
子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決
定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原
的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固
相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與
其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受
檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)
生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。
包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的
腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清中將出現(xiàn)雜抗
體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。抗血清不能直接
用于包被，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽
析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提
高試驗(yàn)的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中
單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適
當(dāng)稀釋后直接包被，必要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì)
一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材
料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用
pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入
包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被
的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的
濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉（blocking）是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w
包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相
關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手
續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血
清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可
以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶
粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需
封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活
性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，
因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。
但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的（見(jiàn)2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密
封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。
結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中zui關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是
既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗
原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶
或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)
定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。
在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)
物易于測(cè)定等。
在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和堿性磷
酸酶（alkaline phosohatase, AP）。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化
酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分
子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一
種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉
環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有zui高吸收峰。HRP的純度用RZ（Reinheit Zahl，德文，意為純度
數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值
得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。高純度的酶如保存不
當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物
量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。
國(guó)外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別
從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取
的AP分子量為80000，酶作用的pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為
100000，zui適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較
低，但AP價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。
制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干
擾。用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀
釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F（ab'）2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。
在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。
?。?/span>1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)
它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊
二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）
和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)
合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，
先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先
將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比
例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較
一步法低。
?。?/span>2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常用
此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基
形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其*比例為：酶/抗體=1-2/1。此
法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。
按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有
的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)*洗滌，游離酶可被除去，并
不影響zui終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減
少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體
后用于檢測(cè)，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽
析法zui為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的
游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開(kāi)。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高
效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取
得*的分離效果，但費(fèi)用較貴。
結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過(guò)濃的結(jié)合
物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須
對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)
低的本底，并獲得測(cè)定的*靈敏度，達(dá)到zui合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)
抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反
應(yīng)的zui高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)
1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體
的ELISA檢測(cè)中，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度
以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)
行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。
酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較
為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且
使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的
冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以
稀釋液（見(jiàn)3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液。現(xiàn)在較*的ELISA試劑盒均已
用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白
質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如*）和
防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體
上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以
抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，
如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也
可應(yīng)用這種稀釋液。
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶
作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-
phenylenediamine,OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS
[2,2'-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度
高，比色方便，是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶
性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底
物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD
可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配
入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。*的ELISA試劑盒中
則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)
用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試
劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等
優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈
黃色，可在比色計(jì)中定量，zui適吸收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，
經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定
量測(cè)定的線性范圍。
HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物
（urea peroxide）。H2O2應(yīng)用zui多，但尿素過(guò)氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)
定。試劑盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2
～8℃）可穩(wěn)定1年。
AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP）作為底
物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用
NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。
AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用
顯色底物的比色法。
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的zui終體積而異，在板式
ELISA中一般采用2mol/L。
陽(yáng)性對(duì)照品（positive control）和陰性對(duì)照品（negative control）是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控
制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與
檢測(cè)標(biāo)本的組成相*。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜?/span>
清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國(guó)外試劑
盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿（recalcified human plasma）為原料，即在血漿中加入鈣離
子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對(duì)照品
須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，zui
好抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待
檢物質(zhì)，此量在試劑說(shuō)明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測(cè)定中得到
的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)
HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。在對(duì)照
品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
定量測(cè)定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用
的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑
的緩沖液中。
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