使用蛋白聚集分析試劑盒
蛋白聚集嚴重影響以蛋白為基礎研發(fā)的藥物。在藥物制劑中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影響藥效。
蛋白聚集發(fā)生在生產(chǎn)過程的各個階段包括細胞培養(yǎng)、純化、生產(chǎn)、儲存、運輸?shù)确矫妗Ｖ扑幑I(yè)希望在生物工藝中找到新的方法，可用于檢測、追蹤、定量分析影響蛋白聚集的因素。
近年來以凍干穩(wěn)定形式存在的蛋白聚集體作為標準品，可以準確地定量檢測蛋白聚集，加上新穎的只需在酶標儀里即可實驗的，可對蛋白檢測方法進行優(yōu)化。
在這篇文章中，使用已知濃度的聚集IgG標準品作為標準曲線，通對IgG的聚集水平進行檢測，集中分析了制藥工業(yè)中常見的3種聚集形式。
熱誘導聚集
機械誘導聚集
冷凍和反復凍融誘導聚集
材料和方法
Enzo Life Sciences 推出了ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards，利用熒光分子信號染料可特異性結合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可檢測。
探針在溶液中是不發(fā)出熒光的，當與聚集蛋白的四級結構結合時會發(fā)出明亮的熒光。一旦聚集標準品發(fā)生重組，它們將含有0-12.5%的聚集蛋白，總蛋白濃度維持在1mg/ml。
通過粒子分析成像鑒定標準品發(fā)現(xiàn)90%的蛋白聚集體長度為2-10um，約9%的蛋白聚集體長度為10-20um，約0.7%的蛋白聚集體為長度大于20um。
Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader （BioTek Instruments） 可用于所有蛋白聚集分析。它的激發(fā)波長為500nm，發(fā)射波長為600nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為9nm，便于檢測ProteoStat染料。Thioflavin T染料可以在激發(fā)單色器激發(fā)波長為435nm，發(fā)射波長為495nm，都在激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為9nm的條件下進行檢測。
結果
在96孔微板中檢測比較ProteoStat和Thioflavin T染料與蛋白聚集的結合能力。純化的兔抗羊lgG（4.26 mg/ml）在pH2.7的鹽酸水溶液中，80℃溫度下孵育90分鐘后會形成蛋白聚集體。
聚集信號由聚合體和單體混合比例不同決定的，但總的lgG蛋白濃度仍然是60 ug/ml。在50 mM磷酸鉀，pH 7，3uM ProteoStat 檢測試劑或5uM Thioflavin T 染料中讀數(shù)。這些濃度在以前做過預實驗，已經(jīng)確定是*的濃度。
在蛋白和染料一起孵育15分鐘后使用BioTek Synergy Mx Microplate Reader讀數(shù)。所用的板為Greiner µClear® black, clear bottom 96-well microplates （Greiner Bio One）。
在相同情況下，ProtesStat染料的熒光強度比Thioflavin T染料高100倍。對于濃度為1.2 ug/ml的聚集體，ProteoStat染料的信噪比為12.8，而Thioflavin T染料的信噪比僅為1.2，表明ProteoStat染料在蛋白聚集檢測中更準確、靈敏度更高。
正因為由此顯著的優(yōu)勢，ProteoStat protein aggregation assay和ProteoStat protein aggregation standards通常能夠共同用于各種常規(guī)形式的蛋白聚集檢測。
監(jiān)控熱誘導聚集
當?shù)鞍资艿教岣邷囟却碳铀倨渚奂?。?/span>lgG（4mg/mL）在各個時期都處于攪拌速度400rmp，100mM磷酸鈉，pH7.2，溫度60℃下。
在每個時間點，25ul lgG用于測量。首先樣本在1x assay buffer中稀釋4倍后，得到的蛋白zui終濃度為1 mg/ml。在每個孔中加入98ul的檢測蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個時間點都做平行孔。
同時，ProteoStat protein aggregation standards中含有穩(wěn)定的、高質量的對照樣本，用來做標準曲線。
如圖1所示，使用ProteoStat染料檢測羊lgG在熱誘導下的聚集情況，生成的曲線表明不同階段lgG蛋白聚集的情況。
在剛開始階段蛋白聚集情況較少，接著觀察到生長階段聚集體開始形成，zui后生長率降低直至變成0，表明蛋白單體已幾乎消失，差不多*形成聚集體。
圖1：熱誘導羊IgG蛋白聚集
監(jiān)控機械誘導聚集
雖然普遍認為機械攪拌會加速蛋白聚集形成，但目前機械外力造成蛋白聚集形成的原理還不是十分明確。在藥物研發(fā)中，可能受到抽真空或者過濾等產(chǎn)生的機械外力使蛋白藥物形成聚集。
羊抗鼠lgG（10mg/ml）溶解在含有10mM的磷酸鈉，150mM Nacl，0.05% *，pH7.2的溶液中。機械攪拌的實驗條件如下：室溫、4ml的平底褐色玻璃瓶中加入200ul lgG溶液，使用Variomag® Poly electronic stirrer （2Mag-USA），以990 rpm速度進行攪拌。攪拌棒體積為1.0 x 0.4 x 0.2 cm3。
在每個時間點，取10ul lgG用于檢測。樣品在1x assay buffer中稀釋10倍后，得到的蛋白zui終濃度為1 mg/ml。在每個孔中加入98ul的檢測蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個時間點都做平行孔。
用ProteoStat protein aggregation standards作為標準曲線，定量檢測機械攪拌誘導產(chǎn)生的蛋白聚集。在上述實驗條件下，蛋白聚集與時間成正比例關系（圖2）。
圖2：機械誘導樣抗鼠IgG蛋白聚集
監(jiān)控冷凍和反復凍融誘導聚集
冷凍對于蛋白穩(wěn)定是至關重要的，因為在冷凍過程中會導致溶液的濃度發(fā)生變化。羊抗鼠lgG（10mg/ml） 溶解在10mM的磷酸鈉，150mM Nacl，0.05% *，pH7.2的溶液中。樣品保存在-20℃，反復凍融數(shù)次。
在每個時間點，取10ul lgG用于檢測。樣品在1x assay buffer中稀釋10倍后，得到的蛋白zui終濃度為1 mg/ml。在每個孔中加入98ul的檢測蛋白和2ul的ProteoStat Detection Reagent Loading Solution，每個時間點做平行孔。
用ProteoStat protein aggregation standards作標準曲線，定量檢測反復凍融誘導產(chǎn)生的蛋白聚集體。實驗表明反復凍融也會誘導產(chǎn)生蛋白聚集。與熱誘導引起蛋白聚集一樣，會觀察到一條S型曲線圖。（圖3）
圖3：反復凍融誘導樣抗鼠IgG蛋白聚集
小結
在蛋白聚集實驗研究中，將ProteoStat protein aggregation assay和Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader聯(lián)用，可適合用于監(jiān)測由溫度、機械損傷和反復凍融所引起的蛋白聚集。
穩(wěn)定的蛋白顆粒作為標準品可快速建立標準曲線，加快定量分析蛋白聚集響應。這個檢測方法能夠可靠地檢測到濃縮抗體制劑中小于0.2%的聚集蛋白，線性動態(tài)范圍為2個數(shù)量級。
ProteoStat protein aggregation assay 和ProteoStat protein aggregation standards檢測蛋白聚集特點在于操作簡單，能夠檢測低水平的蛋白聚集情況，只需30分鐘，就能夠得到完整的分析結果。
