*福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片的存檔代表了珍貴且來源廣泛的生物醫(yī)學研究材料。隨著越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向FFPE樣品的分子分析，開發(fā)特定的操作步驟，考慮這些樣品的*性質(zhì)就變得越來越重要。二、從FFPE樣品中提取有用分析物的的關鍵因素
從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白時，目前存在一些主要困難。首先，這些生物分子彼此交聯(lián)。交聯(lián)程度和不可逆交聯(lián)的比例取決于，或部分取決于，福爾馬林固定的持續(xù)時間。其次，核酸常常嚴重片段化，這取決于FFPE樣品如何制備和保存。第三，由于FFPE樣品很珍貴，故只有有限的材料可用于分析物純化和下游分析。因此，所用的純化步驟必須是的，盡可能多地回收有用的分析物。本章介紹了從FFPE樣品中純化DNA、RNA和蛋白的*挑戰(zhàn)，以及如何zui有效地克服它們。
5 總RNA和miRNA的純化
甲醛修飾會影響FFPE樣品中的DNA，這個問題也同樣適用于RNA。全新經(jīng)過優(yōu)化的RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit都是專門為FFPE樣品的RNA純化而設計的（圖11和12）。由于RNA在熱處理時更容易片段化，故試劑盒使用了經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液條件，并降低了孵育溫度。盡管80°C以上的孵育會略微改善RNA在RT-PCR中的表現(xiàn)，但它還是會導致更多RNA片段化。同時，在較低溫度下孵育會導致產(chǎn)量較低，且RT-PCR表現(xiàn)明顯變差。
FFPE樣品先用蛋白酶K在56°C消化15分鐘，以便從交聯(lián)的蛋白分子中釋放RNA分子，之后在80°C孵育15分鐘，以逆轉(zhuǎn)一些甲醛修飾。接著，為避免DNA污染，特別是去除有可能干擾下游分析（如實時定量RT-PCR）的痕量DNA小片段，用DNase Booster和DNase處理RNA。在接下來的步驟中，利用RNeasy MinElute離心柱純化RNA，其中RNA經(jīng)過結(jié)合、洗滌，zui終洗脫在15-30 μl無RNase的水中。取決于結(jié)合條件，低至70 nt的總RNA（RNeasy FFPE Kit）或包含低至18 nt的miRNA的總RNA（miRNeasy FFPE Kit）被純化。鑒于RNA的片段化性質(zhì)，嘗試純化單獨的、富含小RNA的部分是不切實際的。為了提高標準化和便利性，RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit所開展的RNA純化必要時也可在QIAcube上自動開展。
圖11. 來自FFPE樣品的RNA的實時定量RT-PCR分析。利用RNeasy FFPE Kit從大鼠腎臟中純化總RNA。在Rotor-Gene® Q循環(huán)儀上開展PGK1（磷酸甘油酸激酶1）的實時定量RT-PCR分析，加（+RT）或不加（-RT）逆轉(zhuǎn)錄酶。-RT曲線證明了利用RNeasy FFPE Kit純化的RNA幾乎不含基因組DNA。
圖12. 從FFPE組織中純化miRNA。大鼠肝臟組織用福爾馬林固定24小時或60小時，接著用miRNeasy FFPE Kit純化包括miRNA在內(nèi)的總RNA。純化所得的RNA作為模板，并利用miScript PCR System開展實時定量RT-PCR，以檢測miR-16和miR-29a以及較大的PGK1基因mRNA。結(jié)果表明了同一洗脫液中miRNA以及mRNA的成功檢測。
6 蛋白的純化
與核酸不同，F(xiàn)FPE樣品中的蛋白不會遇到片段化的問題。因此，全長蛋白的分離是可以實現(xiàn)的。然而，從FFPE樣品中抽提蛋白時，也會面臨一些重要的問題。首先，如果下游應用需要樣品裂解液，而不是高度純化的蛋白，則石蠟的*去除是必需的。其次，蛋白酶K和高度變性劑不能用來斷開福爾馬林交聯(lián)，因為它們會導致蛋白降解。
蛋白純化的效率受到切片厚度的影響。我們建議樣品厚度在10-15 μm。產(chǎn)量取決于切片中組織的量和組織的性質(zhì)。肝臟組織的3塊10 μm切片的一般產(chǎn)量為1.5 μg/μl，而大腦組織為1.6 μg/μl。
Qproteome FFPE Tissue Kit利用技術從FFPE樣品中回收全長蛋白。在二甲苯多次處理去除石蠟后，組織切片在優(yōu)化的提取緩沖液中孵育2次。*次是100°C、20分鐘，以逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)。第二次是80°C、2小時，以確保蛋白溶解度zui高。zui終獲得了100 μl包含蛋白的裂解液，適用于質(zhì)譜和western blot分析等應用（圖13）。
圖13. 乳腺癌活檢中HER2的檢測。利用Qproteome FFPE Tissue Kit處理8個FFPE乳腺組織，并通過SDS-PAGE分離蛋白。在western blotting之后，與HER2（上圖）或β-actin（下圖，對照）抗體雜交。在從FFPE組織提取的蛋白樣品中，可檢測到HER的p185和p95形式。（數(shù)據(jù)由德國慕尼黑理工大學的Karl-Friedrich Becker和Christina Schott友情提供。）
Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit提取的蛋白適用于2D-PAGE。在為2D-PAGE樣品專門開發(fā)的脫蠟步驟后，使用與Qproteome FFPE Tissue Kit相同的提取緩沖液逆轉(zhuǎn)福爾馬林交聯(lián)?；厥蘸蟮牡鞍卓擅擕}，以去除可能影響下游2D-PAGE分析的鹽。純化的蛋白同樣適用于質(zhì)譜分析（圖14）。
圖14. 來自FFPE和新鮮冰凍樣品的蛋白的質(zhì)譜分析。利用Qproteome FFPE Tissue 2D-PAGE Kit從FFPE和新鮮冰凍的大鼠肝臟中純化蛋白。3塊150 mm2 FFPE組織切片的蛋白產(chǎn)量是80 μg。圖中顯示了A 水解FFPE和B 新鮮肝臟組織的LC耦合串聯(lián)質(zhì)譜分析的總離子流圖。160分鐘內(nèi)上樣的LC梯度是5%-40%溶劑B。分析是在Orbitrap™ XL質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技）上開展的，將5 μg*水解肽段混合物上樣到與質(zhì)譜儀耦合的HPLC柱中，這些肽段來自從A FFPE或B 新鮮冰凍組織中提取的蛋白水解產(chǎn)物。在分析相同量的起始材料時，新鮮冰凍和FFPE組織都鑒定出大約86.7%的總蛋白。（數(shù)據(jù)引用自Geoui, T. et al. [2010] Extraction of Proteins from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Using the Qproteome Extraction Technique and Preparation of Tryptic Peptides for Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. 90, 10.27.1）
7 多個分析物的同時純化
如果能夠同一個FFPE樣品中純化得到DNA和RNA，那么可以實現(xiàn)基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠比較。在研究健康和惡性細胞呈異質(zhì)性分布的腫瘤組織時，這尤為重要：它意味著同一個樣品的不同切片可能在細胞組成上存在不同。將樣品分成兩半，進行不同的DNA和RNA純化操作，會導致不同細胞群體的DNA和RNA的純化，而它們的性質(zhì)可能不同。從同一個樣品中純化DNA和RNA可避免浪費，因為FFPE樣品很珍貴，往往難以提取，且數(shù)量有限。
然而，從同一個樣品中分離DNA和RNA存在一個主要障礙：片段化的DNA很短，且部分是單鏈的，因此與RNA更為相似。片段化DNA的這種性質(zhì)造成DNA和RNA的物理分離十分困難。AllPrep® DNA/RNA FFPE Kit利用一種申請中的溶解方法來分別釋放單個FFPE樣品中的DNA和RNA。通過這種方法，F(xiàn)FPE樣品在一種經(jīng)過優(yōu)化的裂解液中孵育，導致RNA的釋放和DNA的沉淀。離心之后，包含RNA的上清和包含DNA的沉淀可分別處理，以純化RNA和DNA。進一步孵育部分逆轉(zhuǎn)了交聯(lián)，之后利用RNeasy MinElute離心柱或QIAamp MinElute離心柱純化RNA或DNA。對于純化后的RNA，柱上DNase處理可去除任何污染的DNA（圖16C）。
取決于RNA結(jié)合條件，小的RNA如miRNA可能存在于純化后的RNA中，也可能不存在。對于純化后的DNA，可選擇柱上RNase處理，因為離心柱處理之前的DNA和RNA分離，RNA污染很少。
利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit純化得到的DNA和RNA與分別利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和RNeasy FFPE Kit/miRNeasy FFPE Kit純化得到的DNA和RNA質(zhì)量相當（圖15）。因此，純化得到的核酸適合實時定量PCR和RT-PCR（圖16）或焦磷酸測序等下游應用。
圖15. FFPE樣品中DNA和RNA的純化。A 從各種大鼠FFPE組織中純化的基因組DNA在室溫下保存時間。純化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（作為對照，一個專門從FFPE樣品中純化DNA的試劑盒）開展的，兩者都包含了RNase消化。通過測量吸光度來確定每個20 μm 切片樣品的DNA產(chǎn)量。B 從各種大鼠FFPE組織中純化的RNA在室溫下保存時間。純化是利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或RNeasy FFPE Kit（作為對照，一個專門從FFPE樣品中純化RNA的試劑盒）開展的。通過測量吸光度來確定每個10 μm 切片樣品的RNA產(chǎn)量。在回收FFPE樣品中的DNA/RNA時，AllPrep試劑盒的表現(xiàn)與專門的DNA/RNA純化試劑盒一樣好。
圖16. FFPE樣品中DNA和RNA的可靠擴增。利用AllPrep DNA/RNA FFPE Kit或作為對照的專門從FFPE樣品中純化DNA或RNA的試劑盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或RNeasy FFPE Kit）從各種大鼠FFPE組織中純化A DNA和B, C RNA。在ABI PRISM® 7900HT 序列檢測系統(tǒng)上開展實時定量PCR或RT-PCR，A 利用QuantiTect SYBR Green PCR Kit來分析Prnp基因的78 bp擴增子，或B, C 利用QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit來分析Jun癌基因表達。AllPrep試劑盒和專門的試劑盒產(chǎn)生了相當?shù)腃T值，說明所有試劑盒在回收可用的DNA或RNA上效率相似。C 此外，Jun表達的分析在無逆轉(zhuǎn)錄酶（-RT）下開展。脾臟樣品（富含DNA的組織）的擴增曲線表明幾乎沒有基因組DNA污染。
8 提取和純化的自動化
FFPE分析物純化的自動化具有一些優(yōu)勢，包括純化過程標準化的提高和勞動力的降低。它還有利于多個樣品的處理。QIAcube讓QIAGEN離心柱試劑盒自動化，包括QIAamp DNA FFPE Tissue Kit、RNeasy FFPE Kit和miRNeasy FFPE Kit，讓您快速啟動低通量的自動化純化（每次zui多運行12個樣品）。對于低-中等通量的FFPE樣品的DNA純化，EZ1® Advanced儀器每次運行可純化1-6或1-14個FFPE樣品，它使用EZ1 DNA Paraffin Section Card和EZ1 DNA Tissue Kit。EZ1 Advanced儀器帶來了高的操作安全性，無憂的數(shù)據(jù)管理和快速運行時間。
