隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞群體的研究已不再能滿足我們的需要?？茖W(xué)家們開始解析單個細(xì)胞的行為。而單細(xì)胞技術(shù)在zui近幾年也一直被《Nature Methods》雜志列為值得關(guān)注的技術(shù)。
如今，單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究不再是遙不可及。利用新興的微流體方法和分子生物學(xué)技術(shù)，研究人員逐漸能從群體噪音中提取單細(xì)胞信號?！禛enome Technology》雜志請來了一些專家，來分享他們在單細(xì)胞分析上的經(jīng)驗。通過一問一答的形式，希望能為您的研究帶來一點(diǎn)啟發(fā)。
Q1：您的細(xì)胞捕獲和裂解方法是哪種？為什么？
Q2：您如何產(chǎn)生適合qPCR的單細(xì)胞cDNA文庫？
Q3：在改善單細(xì)胞qPCR實驗設(shè)計上，您有哪些建議？
Q4：您采取哪些步驟來減少實驗誤差以及噪音？
Q5：您如何定量單細(xì)胞qPCR結(jié)果？
Q6：您分析時使用哪些生物信息學(xué)工具？Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們zui常用的是熒光活化細(xì)胞分選（FACS）。對于可分離的樣品，F(xiàn)ACS在高通量工作中zui方便，并且可輕松整合到我們的流程。我們對特定細(xì)胞類型也使用免疫磁性富集，例如，收集循環(huán)中的癌細(xì)胞。對于裂解，我們使用自己的CelluLyser或羅氏的Real-Time Ready Cell Lysis試劑盒。
Anders Ståhlberg（哥德堡大學(xué)）
顯微抽取、流式細(xì)胞術(shù)、激光捕獲顯微切割（LCM）或自動化的微型設(shè)備都可用來收集單個細(xì)胞。每種方法都各有利弊。目前我正在使用流式細(xì)胞儀來收集各種細(xì)胞類型。FACS將細(xì)胞分選到PCR板上，與RT-qPCR儀器兼容。此外，F(xiàn)ACS可利用特定的細(xì)胞標(biāo)志物實現(xiàn)細(xì)胞富集。FACS的通量比LCM要高得多。但FACS的缺點(diǎn)是你無法觀察細(xì)胞，確定重要參數(shù)，如細(xì)胞形態(tài)。FACS還需要單細(xì)胞懸液，因此，細(xì)胞的過去無從知道。
為避免RNA損失，我們使用與下游酶學(xué)反應(yīng)兼容的裂解緩沖液，而無需進(jìn)一步純化。目前市場上有一些裂解液可供選擇：CelluLyser（TATAA生物中心）、Real-Time Ready Cell Lysis（羅氏）、Single Cell-to-CT（Life Technologies）等。我們注意到，不同的細(xì)胞類型需要不同的裂解液。我們傾向于使用弱的裂解液—水和非商業(yè)化的緩沖液—以避免對下游反應(yīng)的抑制。如果需要較強(qiáng)的裂解液，我曾用過CelluLyser和Real-Time Ready Cell Lysis緩沖液，還不錯。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學(xué)院）
根據(jù)我們的經(jīng)驗，假陽性是單細(xì)胞qPCR中的一個主要問題，特別是原代解離細(xì)胞。因此，對于原代解離細(xì)胞，我們傾向于通過玻璃移液管來收集細(xì)胞質(zhì)。在處理細(xì)胞系時，收集整個細(xì)胞通常效果不錯。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
我們在單細(xì)胞分離上曾使用過幾種方法，如細(xì)胞捕獲、細(xì)胞顯微操作等。理想方法是取決于樣品的性質(zhì)和研究目的。
我們曾成功使用細(xì)胞顯微操作儀在顯微鏡下分離單個真核細(xì)胞和細(xì)菌。單細(xì)胞可捕獲并加入預(yù)裝有40μL PBS緩沖液的PCR管（0.2 mL）或微管（1.5 mL）中。隨后細(xì)胞可利用商業(yè)化的試劑盒（如ZR RNA MicroPrep Kit，Zymo Research）裂解以分離RNA，或裂解后直接開展RT-PCR。顯微操作的缺點(diǎn)在于其通量的確不高。Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我們只通過基于PCR的預(yù)擴(kuò)增。在我們看來，TaqMan PreAmp Master Mix（Life Technologies）是*的試劑盒。正確處理樣品是zui重要的。沒有經(jīng)驗的話，很容易犯錯誤。我們在歐洲提供單細(xì)胞圖譜分析服務(wù)，包括與Life Technologies合作，通過數(shù)字PCR來準(zhǔn)確測定拷貝數(shù)。
Finn-Arne Weltzien（挪威獸醫(yī)學(xué)院）
我們對細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞裂解液直接開展逆轉(zhuǎn)錄。
Weiwen Zhang（亞利桑那州立大學(xué)，現(xiàn)在天津大學(xué)）
從單細(xì)胞中分離RNA之后，使用適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄步驟。產(chǎn)生的cDNA通常足以測定單細(xì)胞中十幾個高表達(dá)的基因。不過，如果要測定更多的基因，需要擴(kuò)增cDNA。目前文獻(xiàn)中有幾種方法來擴(kuò)增cDNA，不過它們可能的偏向仍有待進(jìn)一步評估。
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