鑒定導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)化的分子事件，對于通過發(fā)展靶向藥物來提高肺癌的臨床治療效果非常重要。在過去的十年中，很多研究已經(jīng)報道了關(guān)于非小細(xì)胞肺癌（NSCLCs）基因組上的驅(qū)動突變。然而，仍然不清楚超過40% NSCLCs的分子致病機理。為了鑒定NSCLCs的新分子靶標(biāo)，我們對一個33歲肺腺癌病人（該病人不吸煙而且沒有家族癌癥史）的癌癥組織和正常組織分別進(jìn)行全基因組和轉(zhuǎn)錄組高通量測序。在該癌癥樣本中并未發(fā)現(xiàn)EGFR、KRAS或EML4-ALK融合基因等已知驅(qū)動突變。這里，我們報道了在KIF5B和RET原癌基因之間通過10p11.22–q11.21臂間倒位產(chǎn)生的新融合基因。此融合基因過度表達(dá)了嵌合的RET受體*激酶，它能自發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在20個原發(fā)肺腺癌的驗證研究中，我們在2個肺腺癌中鑒定到了KIF5B-RET融合基因。我們的數(shù)據(jù)表明，一部分NSCLCs是由KIF5B-RET融合基因?qū)е碌摹Ｇ逗系闹掳┗蚩勺鳛橐环N很有前景的分子靶標(biāo)，用于肺癌的個性化診斷和治療。
1、 研究背景
肺癌是死亡率zui高的癌癥之一，世界上每年有138萬人死于肺癌。肺癌晚期病人的平均存活期自診斷時計算不足1年。在西方國家，吸煙是引起肺癌的主要風(fēng)險因素，其中85%~90%的肺癌與吸煙有關(guān)。然而，世界范圍內(nèi)25%的肺癌患者是從不吸煙的。很多亞洲國家的數(shù)據(jù)顯示，從不吸煙者占非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的30%~40%。肺癌中80%為NSCLC，主要組織類型是腺癌（>50%）。
過去幾年中，在NSCLC中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些體細(xì)胞突變，如EGFR，KRAS，EML4-ALK。但大部分肺癌患者的基因組中并沒有發(fā)現(xiàn)這些突變。超過40%的NSCLC是由未知的遺傳變異造成的。
2、研究策略
樣本：
33歲男性，自祖父母開始沒有家族史，從不吸煙，之前一直很健康。在肺葉右上方有未明顯分化的腺癌，在PET研究中發(fā)現(xiàn)已轉(zhuǎn)移到肝臟和多處骨骼，在病理診斷時，通過CT和超聲引導(dǎo)分別對原發(fā)肺癌組織和肝轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行活檢，在已知突變EGFR,KRAS,EML-ALK的檢測中呈陰性。其中，樣本來自首爾國立大學(xué)基因組醫(yī)學(xué)研究所（見圖1）。
癌組織為石蠟包埋的原發(fā)肺腺癌組織，骨骼轉(zhuǎn)移組織和冷凍的肝轉(zhuǎn)移活檢組織，對照為同一病人的外周血。進(jìn)行已知基因排查時，用PCR和Sanger測序檢測原發(fā)肺腺癌組織中的EGFR和KRAS突變，用FISH檢測EML4-ALK突變，結(jié)果全呈陰性。
圖1. 通過CT引導(dǎo)在原發(fā)肺癌組織進(jìn)行活檢后，伊紅染色的石蠟切片
實驗方法：
從原發(fā)肺癌組織，骨骼轉(zhuǎn)移組織，肝轉(zhuǎn)移組織和血中提取DNA，從冰凍肝轉(zhuǎn)移組織提取RNA，從total RNA中合成cDNA。根據(jù)Illumina的標(biāo)準(zhǔn)protocol建庫，用HiSeq2000和Genome Analyzer IIX測序。通過對肝轉(zhuǎn)移組織和血分別進(jìn)行47.77X和28.27X全基因組測序。骨轉(zhuǎn)移樣品和原發(fā)癌樣品都是石蠟包埋，提取出的DNA質(zhì)量不足以高通量測序建庫，只能用于驗證。因此本研究主要基于肝轉(zhuǎn)移和血之間序列的比較（見表1）。
表1. 肺癌病人AK55測序分析的統(tǒng)計總結(jié)
為了進(jìn)行重復(fù)驗證，先選擇5個EGFR,KRAS和EML4-ALK檢測呈陰性的冰凍原發(fā)肺腺癌組織，用HiSeq2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。另外，再選擇15個冰凍原發(fā)肺腺癌組織，通過PCR和Sanger測序檢測EGFR和EML4-ALK呈陰性，KRAS狀態(tài)未知。
在全基因組測序的數(shù)據(jù)分析中，用GSNAP將短reads比對到參考人類基因組（Build36.3,hg18），找出SNV, short indel和large deletion。在轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)分析中，用GSNAP將短reads比對到一些構(gòu)建好的mRNA序列而不是參考人類基因組，以避免mRNA剪接導(dǎo)致的比對錯誤。通過PCR和Sanger測序，對KIF5B-RET融合基因進(jìn)行驗證。
3、研究結(jié)果
在肝組織里發(fā)現(xiàn)了10,390非同義SNVs，334 CDS indels，70 CDS large deletions。與血對比后剩下8非同義SNVs 和2 indels。SIFT注釋后，發(fā)現(xiàn)8個非同義SNVs 的功能不足以導(dǎo)致癌癥，被過濾。
對肝轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（15.16G），并與全基因組測序比較（見圖2），發(fā)現(xiàn)了52個融合基因和10個RNA 編輯。但10個RNA編輯的功能影響不足以成為driver mutation，被過濾。
圖2. 肝轉(zhuǎn)移肺癌組織的全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)
52個融合基因中，49個是相鄰基因間（<135kb）的染色體內(nèi)融合，這可能在癌癥發(fā)生中不起作用。有1個是染色體間融合，是由在肝臟中高度表達(dá)的haptoglobin （HP） 產(chǎn)生。但此基因功能被認(rèn)為對細(xì)胞轉(zhuǎn)換沒有影響。剩下的KIF5B-RET和KIAA1462-KIF5B融合基因是較遠(yuǎn)基因間（>2MB）的染色體內(nèi)融合。不過KIAA1462-KIF5B表達(dá)水平很低，且KIAA1462為分子功能未知的假設(shè)蛋白。只有KIF5B-RET可以在肝轉(zhuǎn)移肺癌組織的全基因組序列中找到對應(yīng)的染色體重排，并且在血的全基因組序列中沒有找到對應(yīng)的染色體重排。此融合基因之前未在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)（見圖3、4）。
圖3. KIF5B-RET融合激酶的功能結(jié)構(gòu)域
圖4. KIF5B-RET融合激酶的三維結(jié)構(gòu)
通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了此融合基因的特征。此融合轉(zhuǎn)錄本高度表達(dá)，表現(xiàn)為34個discordrdant PE reads和60個跨過外顯子接合點的spanning reads（見圖5）。
圖5. 通過跨過外顯子交界處的測序結(jié)果檢測出KIF5B-RET融合基因
在技術(shù)性驗證中，通過PCR和Sanger測序在肝轉(zhuǎn)移肺癌組織的cDNA中也驗證到此融合轉(zhuǎn)錄本。而且有較多reads（8 reads）支持，可以確定存在于肝轉(zhuǎn)移肺癌組織的主要亞群中（見圖6、7）。
圖6. 通過跨過外顯子交界處的測序結(jié)果
圖7. 通過Sanger測序在cDNA驗證融合基因斷裂點檢測出KIF5B-RET融合基因
KIF5B和RET彼此相距10.6Mb，分別位于10p11.22和10q11.2，在兩條不同的鏈上，通過染色體反轉(zhuǎn)形成融合基因（見圖8）。
圖8. 10號染色體發(fā)現(xiàn)的10.6 Mb反轉(zhuǎn)
通過PCR和Sanger測序，在肺癌患者的原發(fā)癌組織、骨骼和肝臟轉(zhuǎn)移肺癌組織的DNA中驗證到染色體反轉(zhuǎn)，從而確定此融合基因不僅存在原發(fā)肺癌組織，還存在于骨骼和肝臟轉(zhuǎn)移肺癌組織中（見圖9）。
圖9. 通過反轉(zhuǎn)特異性PCR和電泳檢測KIF5B-RET融合基因
通過Sanger測序鑒定到染色體反轉(zhuǎn)的斷裂點。斷裂點 （chr10: 42,931,604, hg18）下游2bp處鑒定1bp的刪除，這表明錯誤DNA修復(fù)機制可能在雙鏈DNA斷裂后促成了反轉(zhuǎn)（見圖10）。
圖10. Sanger測序鑒定染色體反轉(zhuǎn)的斷裂點
為了確定KIF5B-RET是否存在于其他原發(fā)肺腺癌組織中，選擇5個沒有EGFR,KRAS,EML4-ALK突變的原發(fā)肺腺癌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，在其中一個（LC_S2）發(fā)現(xiàn)也存在KIF5B-RET融合基因。用cDNA PCR進(jìn)行技術(shù)驗證時，也在LC_S2中驗證到此融合轉(zhuǎn)錄本（見圖11）。
圖11. 針對KIF5B-RET 融合轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行cDNA PCR和凝膠電泳
另外，還挑選15個原發(fā)肺腺癌組織用cDNA PCR進(jìn)行驗證，它們沒有EFGR和EML4-ALK突變，KRAS突變情況未知。其中一個（LC_S6）顯示有KIF5B-RET融合基因。以上驗證結(jié)果顯示，KIF5B-RET融合基因不是稀有的，也存在于原發(fā)肺腺癌中（見圖12）。
圖12. 針對KIF5B-RET 融合轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行cDNA PCR和凝膠電泳
通過Sanger測序鑒定出3個樣本中KIF5B-RET融合基因的斷裂點。外顯子的銜接方式各不相同（見圖13）。
圖13. AK55、LC_S2和LC_S6的KIF5B-RET融合轉(zhuǎn)錄本比較（藍(lán)色代表KIF5B 的外顯子，紅色代表RET的外顯子）
4、討論
• 樣本的正確設(shè)置是成功的前提，此樣本具有典型特征：不吸煙者、年輕、多處轉(zhuǎn)移、無家族史、無已知突變。
• 在不遠(yuǎn)的未來，全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序是進(jìn)行癌癥診斷一項非常重要的程序，尤其對于那些癌組織中不存在已知癌癥driver突變的患者。全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合研究具有重要優(yōu)勢：首先，DNA和RNA測序數(shù)據(jù)之間的互相檢驗可以去除很多假陽性。人類基因組大約3G，即使全基因組測序的準(zhǔn)確性達(dá)到99.9999%，一般也會產(chǎn)生數(shù)千個假陽性。第二，轉(zhuǎn)錄組測序能讓我們只關(guān)注與活躍轉(zhuǎn)錄基因相關(guān)的特定基因組變異。癌癥基因組包括數(shù)百個體細(xì)胞passenger突變，要從中分離出driver突變，需要表達(dá)水平的信息。第三，這樣可以發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生變異，如RNA編輯。zui后，轉(zhuǎn)錄組測序比全基因組測序更容易提供由染色體反轉(zhuǎn)或移位產(chǎn)生的融合基因的信息。
• 總結(jié)下支持KIF5B-RET融合基因具有致癌作用的證據(jù)。（1）通過分析發(fā)現(xiàn)的此融合基因，是基于不含任何已知driver突變的肺癌；（2）RET在其他癌癥患者也是致癌基因；（3）RET的tyrosine激酶結(jié)構(gòu)域只在含有此融合基因的肺癌樣本中高度表達(dá)；（4）伴侶基因（KIF5B）有coiled-coil結(jié)構(gòu)域，是激活致癌融合基因所必需的。
• 我們除了在一個肝轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了1個KIF5B-RET融合基因，還在20個原發(fā)肺腺癌中發(fā)現(xiàn)了2個，因此我們估計此融合基因在肺腺癌中的頻率為6%。不過此研究的樣本量太小，還需流行病學(xué)研究來更準(zhǔn)確地了解KIF5B-RET融合基因的頻率?？傊@次發(fā)現(xiàn)的新KIF5B-RET融合基因可能作為治療肺癌的一個好的分子靶標(biāo)。
參考文獻(xiàn)
A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Research, 2011.
