人巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)ELISA試劑盒 檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被人γ干擾素(IFN-γ)捕獲抗原的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人γ干擾素(IFN-γ)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀(450nm)
2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
人巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)ELISA試劑盒 操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
3. 預(yù)處理后的樣本無需稀釋,直接取10μL加樣即可。
4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標(biāo)板8孔×12條12孔×4條無
標(biāo)準(zhǔn)品(1000 pg/ml)0.6mL0.6mL按說明書進(jìn)行稀釋
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6mL3mL按說明書進(jìn)行稀釋
*6mL3mL按說明書進(jìn)行稀釋
檢測抗體-HRP10mL5mL無
20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋
底物A6mL3mL無
底物B6mL3mL無
終止液6mL3mL無
封板膜2張2張無
說明書1份1份無
自封袋1個1個無
注:標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為:1000、500、250、125、62.5、0pg/ml.
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
2. 自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
人巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)ELISA試劑盒 操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔,空白孔什么都不加;標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL,再加*40μL;
4. 隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中(空白孔不加)加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6. 所有孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 所有孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。
2. 靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 pg/ml。
3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
6. 有效期:6個月
7. 檢測范圍:31.2pg/ml-1000pg/ml
免責(zé)聲明
1. 試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或人體實驗,否則所產(chǎn)生的一切后果,由實驗者承擔(dān),本公司概不負(fù)責(zé)。
2. 嚴(yán)格按照說明書操作,不同批號不可交換使用,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔(dān)。