現(xiàn)貨大鼠碳酸酐酶（CA）ELISA試劑盒
  說(shuō)明書的詳細(xì)信息

產(chǎn)品名稱：  現(xiàn)貨大鼠碳酸酐酶（CA）ELISA試劑盒
英文名稱：Rat carbonic anhydrase,CA ELISA 試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：B-22644
產(chǎn)品性狀：液體

產(chǎn)品用途：科研實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)品規(guī)格：96T/48T

 的概念、原理、操作步驟

ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 　　

（一）　原理

ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法（圖a）、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。 　　

（二）　操作步驟

方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：　　　

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。

（三）　試劑器材

1.　試劑

（1）　包被緩沖液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液）:

NaCO3　1.59克　NaHCO3　 2.93克　　加蒸餾水至1000ml　　

    （2）　洗滌緩沖液（PH7.4 PBS）：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml

（3）　稀釋液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克　加洗滌緩沖液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。

（4）　終止液（2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。

（5）　底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml　0.1M 檸檬酸（19.2克／L） 24.3ml　加蒸餾水50ml。 

（6）　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml無(wú)水乙醇） 0.5ml底物緩沖液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2　32μl

（7）　ABTS使用液:ABTS　0.5mg　底物緩沖液（PH5.5） 1ml　3％H2O2　2μl

（8）　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

（9）　正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。

2.　器材:

（1）　聚苯乙烯塑料板（簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

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