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猴子水痘帶狀皰疹病毒IgG（VZV-IgG）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

閱讀：516發(fā)布時間：2014-2-28

　　本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測猴子血清，血漿中水痘帶狀皰疹病毒IgG（VZV-IgG）水平，感染人的血液學(xué)診斷。
　　
　　實驗原理：
　　
　　本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標(biāo)本中猴子水痘帶狀皰疹病毒IgG（VZV-IgG）。用純化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被單抗的微孔中依次加入VZV-IgG,再與HRP標(biāo)記的抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中猴子VZV-IgG的存在與否。
　　
　　試劑盒組成：
　　
　　試劑盒組成48孔配置96孔配置保存
　　
　　說明書1份1份
　　
　　封板膜2片（48）2片（96）
　　
　　密封袋1個1個
　　
　　酶標(biāo)包被板1×481×962-8℃保存
　　
　　陰性對照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　陽性對照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　酶標(biāo)試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
　　
　　濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存
　　
　　樣本處理及要求：
　　
　　1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
　　
　　2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
　　
　　3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
　　
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
　　
　　5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
　　
　　6.標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
　　
　　7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
　　
　　操作步驟：
　　
　　編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）
　　
　　加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
　　
　　溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
　　
　　配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
　　
　　洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
　　
　　加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
　　
　　溫育：操作同3。
　　
　　洗滌：操作同5。
　　
　　顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
　　
　　終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　
　　測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
　　
　　結(jié)果判定：
　　
　　試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10
　　
　　臨界值（CUTOFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
　　
　　陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為VZV-IgG陰性
　　
　　陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為VZV-IgG陽性
　　
　　注意事項
　　
　　1．操作嚴(yán)格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
　　
　　2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
　　
　　3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
　　
　　封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　
　　5．底物請避光保存。
　　
　　6．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
　　
　　7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。
　　
　　保存條件及有效期
　　
　　1．試劑盒保存：；2-8℃。
　　
　　2．有效期：6個月

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