【摘要】  　　目的: 制備抗人骨橋蛋白（hOPN）的單克隆抗體（mAb）, 用于其功能研究。方法: 構建OPN的原核表達載體pTriEx1hONP載體, 轉化Tuner(DE3)placI 感受態(tài)大腸桿菌, 用IPTG進行誘導表達。利用鎳柱親和層析純化OPN蛋白, 純化蛋白經(jīng)超濾濃縮洗滌后即為免疫原。以重組純化的OPN蛋白為免疫原, 免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾細胞和同系小鼠的骨髓瘤細胞Sp2/0進行常規(guī)融合, 通過有限稀釋法進行克隆和間接ELISA篩選, 獲得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的雜交瘤細胞株, 通過ELISA、 Western blot等方法檢測其特異性, 并用免疫組化方法檢測了正常月經(jīng)周期子宮內膜OPN的表達。結果: pTriEx1hONP表達的OPN蛋白主要為可溶性形式, 經(jīng)鎳柱純化后, 蛋白純度可達85％以上。純化的OPN重組蛋白免疫小鼠后經(jīng)融合篩選, 得到2株穩(wěn)定分泌抗人OPN的mAb雜交瘤細胞株, 分別命名為1E7和5B7, 兩株mAb的免疫球蛋白亞類分別IgG1和IgG2a。通過ELISA和Western blot等方法鑒定, 抗OPN的mAb能與OPN蛋白特異性結合。通過免疫組織化學方法對不同時期的正常子宮內膜的OPN的檢測表明, 子宮內膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈 弱陽性表達; 分泌中、 晚期OPN呈強陽性表達。結論: 以純化的重組hOPN為免疫原成功制備了鼠抗hOPN的mAb, 并初步進行了應用, 為研究hOPN的功能打下了良好基礎。

【關鍵詞】  骨橋蛋白; 原核表達; 單克隆抗體

　　骨橋蛋白（osteopontin, OPN）是一種機體反應性的多功能磷酸化糖蛋白, 具有**天冬氨酸（arginineglycineaspartic acid, RGD）序列, 可通過該序列與整合素和CD44結合, 參與細胞的黏附、 遷移等［1］。OPN功能復雜多樣, 與免疫系統(tǒng)、 腫瘤轉移、 消化系統(tǒng)、 泌尿系統(tǒng)、 生殖系統(tǒng)、 骨組織等關系密切, 參與疾病的發(fā)生［2, 3］。近年來有學者發(fā)現(xiàn)子宮內膜、 蛻膜等生殖系統(tǒng)也表達OPN, OPN在胚胎的著床、 生長發(fā)育及分化等方面也起著重要作用, 因此OPN在生殖系統(tǒng)疾病中的作用值得近一步研究［4］。我們通過構建OPN的原核表達載體, 表達純化OPN蛋白并制備小鼠抗人OPN蛋白單克隆抗體(mAb）, 用于OPN的檢測, 以進一步研究OPN與生殖疾病的關系。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  克隆用大腸桿菌DH5α本室保存。表達質粒pTriEx1、 含人OPN cDNA的質粒pET28ahOPN及表達用大腸桿菌Tuner（DE3）placI由哈佛大學劉思金博士惠贈。6～8周齡的BALB/c小鼠（雌性）,  購自中國醫(yī)學*動物所。

　　1.2  方法

　　1.2.1  表達載體的構建  根據(jù)OPN基因序列NCBI（Accession Number:  NM_000582）設計一對擴增引物擴增人OPN基因編碼序列全長: PCR上游引物P1為5′CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3′,  引入Sac I酶切位點, 下游引物P2為5′GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3′引入Xho I 酶切位點。擴增部分為 hOPNcDNA序列（Accession Number:  NM_000582）的2741065位核苷酸。以pET28ahOPN為模板進行PCR擴增。PCR反應條件為94℃預變性 3 min, 然后94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃  1 min 循環(huán), 共30個循環(huán), zui后72℃延伸10 min, PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后和pTriEx1均以Sac I和Xho I酶切并純化, 二者用T4 DNA連接酶16℃連接過夜, 轉化大腸桿菌DH5α, 將菌液涂布于含100 mg/L氨卞*的LB平板, 篩選陽性克隆并進一步用PCR和測序進行鑒定。

　　1.2.2  OPN蛋白的誘導表達和純化  挑取鑒定正確的pTriEx1hONP質粒轉化大腸桿菌Tuner（DE3）placI, 挑取單個陽性克隆接種于含有5 mL  LB培養(yǎng)基（含氨芐*100 mg/L, 10 g/L的葡萄糖）中, 37℃ 250 r/min 搖菌至A值達0.5左右時, 加入濃度為1 mmol/L的IPTG, 誘導3 h后離心收集菌體, 同時在誘導前取樣作為對照。收集的菌體經(jīng)超聲裂解后取上清和沉淀分別進行SDSPAGE電泳, 考馬斯亮蘭染色分析。按上述方法對pTriEx1hONP進行大量誘導表達蛋白, 取出培養(yǎng)物5 000 r/min離心收集細胞, 超聲破碎細胞, 鎳離子金屬鰲合柱（NiNTA）純化目的蛋白, 收集洗脫液, 經(jīng)SDSPAGE鑒定后超濾管超濾濃縮洗滌后備用。

　　1.2.3  鼠抗人OPN mAb的制備  純化后的OPN抗原與等體積的*弗氏佐劑混合, 充分攪拌直至成為油包水, 腹部皮下多點注射。每只小鼠注射20 μg抗原, 共注射5只小鼠。2周后同劑量抗原加福氏不*佐劑加強免疫, 加強免疫2次。后一次加強免疫7 d后以間接ELISA檢測小鼠血清抗人OPN多抗的效價, 效價高者尾靜脈再沖擊免疫1 次, 每只20 μg, 3 d后進行細胞融合。將免疫小鼠的脾細胞懸液與體外培養(yǎng)的Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合, 采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)。以重組純化的人OPN蛋白作為抗原（0.4 mg/L）包被酶標96孔板, 間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清, 所測的A490比陰性對照高10倍的克隆, 進行亞克隆化, 并進行擴增凍存。經(jīng)過3次有限稀釋克隆化, 將分泌特異性抗體的雜交瘤細胞系大量擴增并凍存, 長期傳代培養(yǎng)后, 以相同的方法再次克隆化鑒定之。

　　1.2.4  mAb生物學特性的分析和鑒定  （1）mAb的Ig亞類鑒定: 取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液, 用Roch公司提供的IsoStripTM鼠mAb亞類檢測試劑盒進行IgG亞類鑒定。具體操作過程按照說明書進行。（2）應用Western blot測定mAb的特異性。將純化的重組人OPN和pTriEx1hONP轉化Tuner（DE3）placI誘導后的菌體蛋白進行SDSPAGE電泳, 電轉至PVDF膜上, 用50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜, 加入抗人OPN mAb, 室溫反應1 h , TBST（0.1 mol/L Tris.Cl, pH7.5,  0.5 mL/L Tween20）緩沖液洗膜3次, 加入羊抗鼠IgGHRP抗體（1∶10 000稀釋）, 室溫下孵育1 h, TBST洗滌3次。ECL法顯色。（3）mAb效價的檢測: 常規(guī)方法誘生小鼠mAb腹水, 離心取上清分裝, 凍存于-70℃。應用Protein G免疫親和層析法純化mAb, 方法按Pharmaeia公司方法進行。以純化OPN 10 mg/L包被酶標板, 常規(guī)間接ELISA方法檢測純化血清效價。（4）相加實驗: 取上述包被好的抗原酶標孔, 取2株陽性單克隆孔的細胞培養(yǎng)上清為一抗, 進行間接ELISA反應, 測定反應顯色后的A490值, 按公式計算它們的相加系數(shù): AI=［2A1+2/(A1+A2)-1］×100%, 其中A1+2為相加孔吸光值, A1、 A2為非相加孔的吸光值。AI接近100%, 則2個mAb識別不同的抗原表位, AI接近0, 則2個mAb識別相同的抗原表位。

　　1.2.5  免疫組織化學方法檢測子宮內膜OPN的表達  正常人子宮內膜經(jīng)常規(guī)方法固定、 包埋、 切片、 脫蠟、 至水后, PBS洗3次,  30 mL/L H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min, PBS洗滌后微波抗原修復, PBS洗滌后加100 mL/L的山羊血清37℃封閉20 min, 加入雜交瘤培養(yǎng)上清, 4℃孵育過夜, PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后進行DAB顯色, 蘇木素復染, 返藍后封片。

　　2  結果

　　2.1  重組質粒pTriEx1hOPN的構建和鑒定  以pET28ahOPN為模板, 擴增人OPN的全長791 bp, 與預期結果相符（圖1）。將hOPN亞克隆到原核表達載體pTriEx1多克隆位點中（Sac I和Xho I）。重組克隆經(jīng)酶切及PCR鑒定, 目的片段大小與預期相符（圖2）。測序結果顯示目標序列與NCBI（Accession Number:  NM_000582）相應序列相符, 證實表達載體pTriEx1hOPN構建成功。

　　2.2  hOPN融合蛋白的誘導表達及純化  pTriEx1hOPN陽性菌株經(jīng)IPTG誘導后SDSPAGE電泳顯示: 在37℃、 1 mmol/L IPTG誘導3 h條件下, 融合蛋白表達達到高峰, 蛋白條帶位于Mr約55 000處（比計算的Mr大）。該重組蛋白主要以可溶性形式存在, 用鎳離子金屬鰲合柱（NiNTA）層析柱純化后, 蛋白濃度證實純度在85%以上(圖3)。

　　圖1  OPN PCR擴增產(chǎn)物（略）

　　1: DNA marker DL 2000; 2: PCR擴增的人OPN片段.

　　圖2  pTriEx1hONP酶切鑒定（略）

　　1: DNA marker(λDNA/Hind III+EcoR I); 2:  Sac I和Xho I雙酶切重組質粒pTriEx1hOPN.

　　圖3  重組蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　M: 蛋白質marker;  1, 2:  pTriEx1轉化Tuner（DE3）placI誘導前的上清和沉淀; 3, 4:  pTriEx1轉化Tuner（DE3）placI誘導后的上清和沉淀; 5, 6:  pTriEx1hOPN轉化Tuner（DE3）placI誘導前的上清和沉淀; 7, 8:  pTriEx1hOPN轉化Tuner（DE3）placI誘導前的上清和沉淀; 9: 純化的OPN蛋白.

　　2.3  特異性分泌鼠抗人OPN mAb的雜交瘤細胞株的建立  按常規(guī)方法以重組人OPN蛋白為免疫小鼠后進行細胞融合, 將融合10塊96孔培養(yǎng)板, 融合率約為85％。將復測為陽性的克隆連續(xù)3次克隆化培養(yǎng), 獲得2株持續(xù)分泌特異性抗人OPN mAb的雜交瘤細胞株, 分別命名為1E7和5B7。雜交瘤細胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代培養(yǎng), 液氮凍存半年后復蘇, 仍生長良好, 分泌抗體性能穩(wěn)定。

　　2.4  mAb的特性分析及鑒定  1E7和5B7 mAb的免疫球蛋白亞類分別IgG1和IgG2a, 二者輕鏈均為κ型。經(jīng)Western blot證實2株抗體均可特異性結合表達的OPN蛋白（圖4）。用間接ELISA檢測該2株抗體的效價為1∶10 000以上。相加實驗測得mAb細胞株1E7和5B7培養(yǎng)上清的相加系數(shù)接近于100%, 說明2個mAb可識別OPN的不同抗原表位。

　　2.5  OPN在正常人子宮內膜的表達  免疫組化顯示在子宮內膜腺上皮的增生期和分泌早期, 骨橋蛋白呈弱陽性表達（圖、 B）, 分泌中期和分泌晚期骨橋蛋白在腺上皮腔面, 皆呈中等強度和強陽性表達（圖5C、  D）, 血管內皮細胞呈弱陽性表達, 整個月經(jīng)周期中子宮內膜間質細胞不表達骨橋蛋白。在同一標本中各腺體及腺細胞染色不均勻, 但陽性細胞數(shù)均在50%以上。

　　圖4  OPN mAb的Western blot 鑒定（略）

　　1: pTriEx1hOPN轉化Tuner（DE3）placI后的誘導上清;  2: 純化的 OPN蛋白.

　　圖5  OPN在正常月經(jīng)周期子宮內膜中的表達（免疫組化, ×100）（略）

　　A: 增殖期子宮內膜; B: 分泌早期子宮內膜; C: 分泌中期子宮內膜; D: 分泌晚期子宮內膜.

　　3  討論
    　　
　　近年來OPN表達與生殖的關系逐漸受到人們的重視, 但對OPN在子宮內膜中表達的具體作用知之甚少。OPN作為一種細胞外基質蛋白, 通過在細胞－細胞間, 細胞與ECM間的相互作用中起著重要作用, 幾乎參與了生殖的全過程: 受精, 著床及胎盤的形成, 并在胎盤和子宮的連接、 信號轉導中具有重要作用［5］。OPN表達過量或不足均可能引起疾病, 如不明原因的不孕, 或子宮內膜異位癥等。zui近有報道稱子宮內膜異位證患者的在位內膜及異位內膜均較正常人子宮內膜OPN表達水平高。OPN可能在子宮內膜的侵襲、 轉移中起了重要作用, 也可能由于子宮內膜高表達OPN, 使機體對OPN的免疫應答狀態(tài)發(fā)生了變化。我們用構建的pTriEx1hOPN轉化大腸桿菌Tuner（DE3）placI后成功表達出OPN蛋白, 我們所表達的重組OPN蛋白在SDSPAGE電泳中表現(xiàn)Mr為55 000, 大于其計算Mr（33 000）。OPN的這種異常電泳行為與Helluint等［6］的報道一致。我們經(jīng)免疫融合篩選后獲得2株抗人OPN特異性mAb, 用間接ELISA方法測得其純化腹水效價均在1∶10 000以上, 且為識別OPN不同抗原表位的mAb, 可能用于雙抗體夾心法測定OPN的水平。通過免疫組織化學方法對不同時期的正常子宮內膜的OPN的檢測表明, 子宮內膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈弱陽性表達; 分泌中、 晚期OPN呈強陽性表達, 與有關報道一致［7］。抗人OPN mAb的成功制備不但具有良好的臨床應用前景, 也為我們進一步研究OPN表達與生殖疾病的關系打下了良好基礎。

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