摘要：設(shè)計(jì)針對(duì)human Oct-4的shRNA干擾片段。通過(guò)分子生物學(xué)手段將該干擾片段構(gòu)建入慢病毒載體（pLenti-U6-shRNA-CMV- EGFP-T2A-Puro）的U6啟動(dòng)子下游，該載體可以實(shí)現(xiàn)在干擾Oct-4基因的同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于觀察載體工作狀態(tài)，后者方便篩選Oct-4干擾的穩(wěn)定細(xì)胞株。除了可以直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于Oct-4基因的干擾，該載體更可以包裝慢病毒，用于穩(wěn)定株的篩選以及在動(dòng)物水平干擾Oct-4基因的表達(dá)。
關(guān)鍵詞：Oct-4，RNAi， shRNA， EGFP， puromycin， lentivirus vector

一、 實(shí)驗(yàn)原理
RNA干擾（RNA interference， RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性降低或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。shRNA作為RNA干擾的一種方法，是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ）啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄短的干擾RNA (siRNA， 19-21個(gè)核苷酸的RNA 雙鏈)的DNA分子。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的shRNA被加工后摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex， RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA。
shRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便，而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。
所選用的干擾載體pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro載體圖譜如下。用Age I和EcoR I酶切切去U6啟動(dòng)子下游的ccdB毒性基因，插入待構(gòu)建的shRNA序列。

 
二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
構(gòu)建帶有EGFP熒光標(biāo)記和puromycin抗性基因標(biāo)記的human Oct-4干擾慢病毒載體。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟
根據(jù)human Oct-4基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)3到4個(gè)siRNA靶點(diǎn)，安排引物合成。將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列，連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體，替換掉原來(lái)的ccdB毒性基因。菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，篩選的的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆，進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提。實(shí)驗(yàn)共分以下8個(gè)主要步驟：
1. 干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和引物合成：
根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)的一般原則以及和元生物的豐富經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)3到4個(gè)siRNA靶點(diǎn)，安排引物合成。
2. 引物退火形成帶粘性末端的雙鏈片段：
將合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互補(bǔ)單鏈各取30μl混合。然后將oligo混合物在水浴鍋中95℃加熱5min，然后水浴鍋開(kāi)蓋置室溫中自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。取1μl用于后續(xù)的連接反應(yīng)，其余-20℃保存。
3. 線性化表達(dá)載體的制備：
用限制性內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2μg，10 x反應(yīng)Buffer 5μl，限制性內(nèi)切酶各1μl，去離子水補(bǔ)足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來(lái)，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。
4. 干擾片段連接入表達(dá)載體：

                                                                連接反應(yīng)體系
      

         于16℃ 連接過(guò)夜。

說(shuō)明：陽(yáng)性對(duì)照所加的退火的雙鏈oligo是以前退火好的驗(yàn)證好用的片段，和連接組所加的退火的雙鏈oligo長(zhǎng)度一樣，但序列無(wú)關(guān)。
5. 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：
DH5α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，詳見(jiàn)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。
6. 菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子：
挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10µl LB培養(yǎng)液中，取1µl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和PCR循環(huán)條件如下：

7. 陽(yáng)性克隆送測(cè)序：
菌落鑒定得到的陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用Vector NTI軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
8. 質(zhì)粒小提：
經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆，安排質(zhì)粒小提。具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. siRNA 序列和引物合成：
                                                                 siRNA 序列

病毒載體構(gòu)建框架

DNA引物片段：
pY1001-1  CCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTG
pY1001-2  AATTCAAAAAAAGAAAGAACTCGAGCAATTTCTCTTGAGAATTGCTCGAGTTCTTTCT　
pY1002-1  CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTG
pY1002-2  AATTCAAAAAACCGTGAAGCTGGAGAAGGATCTCTTGAATCCTTCTCCAGCTTCACGG　
pY1003-1  CCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTG
pY1003-2  AATTCAAAAAAGCTTCAAGAACATGTGTAATCTCTTGAATTACACATGTTCTTGAAGC　
pY1004-1  CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTG
pY1004-2  AATTCAAAAAAGGGAGGAGCTAGGGAAAGATCTCTTGAATCTTTCCCTAGCTCCTCCC　
pYNC-GP-1  CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG
pYNC-GP-2  AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

2. 表達(dá)載體的線性化：
用Age I和EcoR I對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，膠回收8.2kb的載體片段，酶切圖譜如下： 
               1    2    3

          
1. 空質(zhì)粒
2. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切的pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro載體

3. 菌落PCR鑒定陽(yáng)性克?。?br />用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6啟動(dòng)子序列中，反向引物pY-SEQR：  CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV啟動(dòng)子的5’序列，陽(yáng)性克隆得到331bp的片段，陰性對(duì)照得到586bp的片段。
pY1001菌落PCR鑒定圖：

      1    2     3      4      5     6      7      8     9     10    11

1. 陰性對(duì)照（空載體）
2. 陽(yáng)性對(duì)照（pYNC-GP質(zhì)粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子

pY1002菌落PCR鑒定圖：
    1    2      3      4      5     6       7     8     9      10   11

 
1. 陰性對(duì)照（空載體）
2. 陽(yáng)性對(duì)照（pYNC-GP質(zhì)粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子

pY1003菌落PCR鑒定圖：

     1      2      3      4      5     6       7     8      9     10    11

 
1. 陰性對(duì)照（空載體）
2. 陽(yáng)性對(duì)照（pYNC-GP質(zhì)粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子

pY1004菌落PCR鑒定圖：

      1    2      3      4      5     6      7      8      9    10    11

1. 陰性對(duì)照（空載體）
2. 陽(yáng)性對(duì)照（pYNC-GP質(zhì)粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子

4. 測(cè)序結(jié)果分析：
pY1001測(cè)序結(jié)果：
CCCCCCCATATCCAGCCTGTTGAGAGAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCATGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGCGACGTAACGCACAGTTCAGCGTGTCGGCGAGGGCGAGGCGATGCCACCTACCGCAGCTGACCTGAAGTCATCTGACACGCAGCTGCTGACTTGACCACCTTTGACACCTGACTACGCGTGATGTCAGCGTAACCGACCATGAGACGACTCTCTAGTCCATGCCAGACTTCTAGAGGACAATTCTTCGAAGATAGAAGCGG

pY1002測(cè)序結(jié)果（由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，2個(gè)陽(yáng)性克隆均測(cè)序中斷）：
pY1003測(cè)序結(jié)果：
CAACCGGGCTTGGTTAGAGAGACATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAcAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACGGGACGCCACCATGTGAGCAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCTGTCGAGCTGACGCGACGTAACGCACAGTCAGCGTGTCGGCAGGCGAGGCGATGCACTACGCAGCTGACCTGAGTCATCTGCACACGCAGCTGCGTGCCTGTACTCGTGACCACCTGACCTACGCTGCATGCTCAGCGCTACCCGACCATGAAGCACCGACTCTCAGTCGCATGCCGAAGGCTCGTCCGGAGGCCAACTTCCAGGCACGGCATTCAGATCCCACCAGGTGAAGTTCCAGGGG

pY1004測(cè)序結(jié)果（由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)，2個(gè)陽(yáng)性克隆均測(cè)序中斷）：
pYNC-GP測(cè)序結(jié)果：
CTTTAATATACTTTGACTGTAAAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGT

TTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGGACGCCACCATGATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACTTACGGGCAGCTGAACCCTTGAAAGTTCATCTGGCCCACCGGCAAGCTTGCCGTGACCTTGACCAGCCATCGTAACCACCCTGACCTACGCGTGCATGCTTCGGCGCTAACCCGGACATGAGCAGCACGGACTTCTTCAAGTTCGGCATGGCCGAGCTACGTCAGAGCGACATCTCTTCAAGACGACGCACTACAGATCCGACGCAGAGTGTAAATCA

五、 參考文獻(xiàn)
1. F.M.奧斯伯等著，馬學(xué)軍等譯，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（第四版），科學(xué)出版社