生物分子類實驗室常用實驗技術(shù)原理 

基本原理:將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在*親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過sds-page電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。注：GST即*巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)
 

二、足印法(Footprinting)

足印法(Footprinting)是一種用來測定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測目的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合。其原理為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase(脫氧核糖核酸酶)分解，在對目的DNA序列進行檢測時便出現(xiàn)了一段無DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸數(shù)目及其核苷酸序列。
 

三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，chip)

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達的關(guān)系。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別 反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的dna片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。
 

四、基因芯片(又稱 DNA 芯片、生物芯片)技術(shù)

基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作 。

基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度zui強的探針位置，獲得一組序列*互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。
 

五、液相色譜(HPLC)

液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬);同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

高壓泵將貯液罐的流動相經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時整個系統(tǒng)就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。
 

六、酵母雙雜交(Y2H)
 

七、噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結(jié)合特性的目標噬菌體。
 

八、RNA提取(Trizol法)

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和*，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的*，而酸性*可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。

九、RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在*條件下進行。

實驗步驟：

1、RNA的提取;

2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;

3、PCR擴增;

4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。
 

十、實時熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。

閾值：是循環(huán)開始3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，設(shè)定在擴增曲線指數(shù)增長期。

C(t)值：熒光信號(擴增產(chǎn)物)到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。

十一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度
 

十二、大腸桿菌感受態(tài)細胞(E.coli DH5α)制備

1、前夜接種受體菌(DH5?或DH10B)，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜(約16小時);

2、取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(250-300rpm);

3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷;以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作;

4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘;

5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘;

7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘;

8 、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮;

9 、細胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑(15% - 20%甘油)后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆?-70℃)。
 

十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA

堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
 

十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選

(1)總過程：

分---PCR分離目的基因

切---限制性內(nèi)切酶切割

接---目的基因與載體相連

轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細胞

篩---篩選陽性重組體

(2)分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選

(3)切---限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端

(4)接---目的基因與載體相連

原 理：利用DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補配對,經(jīng)連接酶作用,完成與載體的連接。

(5)轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細胞

感受態(tài)細胞：經(jīng)過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。

(6)篩---篩選陽性重組體
 

十五、RNA干擾(RNAi)

一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾(RNAi)。

十六、cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)

cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)是一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點,擴增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長cDNA5’和cDNA3’末端，進而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、等優(yōu)點,可同時獲得多個轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術(shù),成為克隆全長cDNA序列的常用手段。
 

十七、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建(看課本上的)
 

十八、mRNA差異顯示技術(shù)(DD-PCR)

mRNA差異顯示技術(shù)是將mRN A逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種細胞(包括同一組織細胞經(jīng)過不同的處理)都有其特異表達的不同于其他組織細胞的基因譜(有差異基因表達)，即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達是細胞分化的基礎(chǔ)，正是這些基因在細胞中的特異表達與否，決定了生命歷程中細胞的發(fā)育和分化、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T-PCR 技術(shù)正是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。 其基本原理是從基因背景相同的2個或幾個被比較的細胞系或組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，用不同引物對，進行PCR 擴增，擴增時加入同位素標記的核苷酸。利用測序膠電泳技術(shù)分離PCR 產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達的基因。
 

十九、抑制差減雜交

抑制差減雜交技術(shù)原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)的主要技術(shù)有兩點:(1)消減雜交;(2)抑制PCR。經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達基因(目的基因),而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除,使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。

抽提兩種不同來源組織的mRNA(tester和driver),反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用4堿基識別酶(RsaI)或HaeIII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testerc DNA分成均等的兩份,分別接上dapter1和adapter2兩種接頭,并與過量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本變性后退火雜交。*次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester和driver的異源雙鏈;d是drivercDNA。

根據(jù)復(fù)性動力學(xué)原理,豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA,因此*次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致。混合兩份雜交樣品,同時加入新的變性driver cDNA 進行第二次消減雜交。雜交*后補平末端,加入合適引物(即adapter1和adapter2的部分特異序列)進行PCR擴增,只有含不同接頭的雙鏈DNA分子(e)才可進行指數(shù)擴增,擴增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點可進行克隆、測序等。
 

二十、蛋白質(zhì)芯片

二十一、Northern blot

二十二、Southern blot

二十三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移

二十四、雙分子熒光技術(shù)

二十五、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

ELISA是一種免疫測定(immunoassay，IA) ?；A(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。
 

二十六、雙向凝膠電泳(2-DE)

雙向凝膠電泳的原理是*向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。
 

二十七、mRNA的分離與純化(寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA)

真核細胞的mRNA分子zui顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚(dT)-纖維素柱層析法zui為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特點，在RNA流經(jīng)寡聚(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚(dT)纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
 

二十八、His-tag純化蛋白

His•Tag序列(6、8或10個連續(xù)的*殘基)與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His•Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結(jié)合。洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標蛋白。該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。

二十九、RNA酶保護試驗方法 (RNase Protection Assay，RPA)

RNA酶保護法是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標記的特異RNA探針(32P或*)與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA;未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2. 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4.步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。6. 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7. 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。
 

三十、免疫組化
 

三十一、各種分子標記技術(shù)的比較

限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標記,開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA 多態(tài)性的新階段,是zui早應(yīng)用的分子標記技術(shù) 。RFLP 是檢測DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA 序列上的微小變化,甚至1 個核苷酸的變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點的丟失或產(chǎn)生, 導(dǎo)致酶切片段長度的變化。

隨機擴增多態(tài)DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術(shù),由于其*的檢測DNA 多態(tài)性的方式使得RAPD 技術(shù)很快滲透于基因研究的各個領(lǐng)域。RAPD 是建立于PCR 基礎(chǔ)之上的分子標記技術(shù),基本原理是利用一個隨機引物(8～10 個堿基) 通過PCR 反應(yīng)非定點地擴增DNA 片段,然后用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA 多態(tài)性研究。對任一特定引物而言,它在基因組DNA 序列上有其特定的結(jié)合位點,一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA 片段插入、缺失或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化,從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變,表現(xiàn)出多態(tài)性。

擴增片段長度多態(tài)技術(shù)(AFLP) ,又名限制片段選擇擴增技術(shù)(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發(fā)明。AFLP 是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子標記技術(shù),它將基因組DNA 用成對的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點互補) 連接起來,并通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA 片段,從而形成指紋圖譜的分子標記技術(shù)。AFLP 指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。

SSR 也稱微衛(wèi)星DNA ,是一類由幾個(多為2～6個) 堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列,其中zui常見的是雙核苷酸重復(fù),即(CA) n和(TG) n ,每個微衛(wèi)星DNA 的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復(fù)單位數(shù)目10～60 個,其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同,導(dǎo)致了SSR 長度的高度變異性,這一變異性正是SSR 標記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA 分子標記,是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異,這種差異包括單個堿基的缺失或插入 ,更常見的是單個核苷酸的替換,且常發(fā)生在嘌呤堿基(A 與G) 和嘧啶堿基(C 與T) 之間。SNP 標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異,被認為是應(yīng)用前景的遺傳標記。