ELISA檢測中陰性本底形成的原因及處理方法
ELISA試驗中，經(jīng)常會碰到陰性本底的問題。主要是本底過高和不同標(biāo)本的本底值差異較大，本底在ELISA中的非特異性顯色。底物未經(jīng)過酶作用而呈現(xiàn)的顏色稱為空白。底物液如配置不當(dāng)會出現(xiàn)一定的空白值。這個值只要不太高（A<0.05),可以從各測定值減除，并不影響實驗結(jié)果。這里討論的是不含代測抗原或抗體的陰性標(biāo)本在ELISA中出現(xiàn)本底。
固相載體的吸附：
在酶免疫測定中，ELISA中的特點是利用固相載體作為分離游離和結(jié)合的酶結(jié)合物的手段。固相載體與吸附在其上的抗原或抗體形成固相抗原或固相抗體，即免疫吸附劑。通常所用的固相載體聚苯乙烯其表面主要是疏水基團(tuán)，通過疏水鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合。這種吸附石物理性的非特異性吸附，雖然蛋白質(zhì)的分子量，等電點,濃度等對吸附的量有一定的影響，蛋總的來說各種蛋白質(zhì)均能吸附在聚苯乙烯載體的表面。因此除在包被時有目的地使抗原或抗體吸附在載體上外，在ELISA各個步驟中均有可能發(fā)生干擾物質(zhì)的吸附，使zui終產(chǎn)生與受檢抗原-抗體反應(yīng)無關(guān)的顯色，這是形成本底的主要原因。
陽性的顯色和陰性的本底
夾心法試驗中，陽性標(biāo)本中含有檢測系統(tǒng)中特異性的抗原或抗體，作為橋梁聯(lián)結(jié)免疫吸附劑和酶結(jié)合物，使酶結(jié)合物吸附在固相上，無色底物在酶的作用下轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物，這就是陽性的顯色，顯色的深度與陽性標(biāo)本中代測抗體或抗原的量成正比。陰性標(biāo)本中不含代測的抗原或抗體，酶結(jié)合物不能聯(lián)結(jié)在固相上，固不顯色。酶結(jié)合物在固相上的非特異吸附通常有以下幾條途徑1·酶結(jié)合物與固相上包被蛋白質(zhì)成分起反應(yīng)。包被抗原不純時，雜質(zhì)蛋白也會吸附在固相載體上，某些雜質(zhì)可與酶標(biāo)抗體因 錯認(rèn) 而結(jié)合。2·酶結(jié)合物直接吸附在固相載體上。酶結(jié)合物是蛋白質(zhì)，可以直接吸附在固相載體表面，試驗中選擇了不利于這種媳婦的條件，一般只要酶結(jié)合物工作濃度適當(dāng)，反應(yīng)一段時間后，經(jīng)過*洗滌，可以避免這種吸附。3·在ELISA中引入*-親和素系統(tǒng)，可以提高檢測的靈敏度，但如果使用不當(dāng)，可使本地加深，反而得不償失。*表及蛋白質(zhì)如比例不合適，極易形成較高的陰性本底。4·雙抗體夾心法中標(biāo)本中含有類風(fēng)濕因子，也可能使陰性血清顯色。類風(fēng)濕因子是作用于多種動物IgG Fe段的自身抗體，多位IgM類，之一種多價抗體。在夾心法檢測中充當(dāng)抗原成分，同時與固相抗體及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，是酶標(biāo)抗體結(jié)合到載體上。
降低陰性本底主要有以下幾個方面:
1·固相載體：在ELISA試驗中有時碰到空白孔吸光值過高或高或赴孔實驗結(jié)果差異很大，其原因可能與酶標(biāo)板質(zhì)量有關(guān)
2·包被抗原：包被抗原應(yīng)先經(jīng)純化。從人血或組織中提取的抗原成分如HB-sAg，要*除去Ig雜質(zhì)是很困難，用基本因工程從組抗原可以避免這種干擾。
3·酶標(biāo)抗體：應(yīng)采用價的酶標(biāo)抗體，工作濃度高，稀釋度大就可以減少吸附。
4·緩沖液：配制試劑的蒸餾水的質(zhì)量十分重要，以新鮮重蒸
其他常見問題：
一、ELISA試驗中結(jié)果顯色淡、靈敏度品低的原因。
1、移液的樣品吸量不足，移液時抽吸、排放太快，移液嘴內(nèi)壁掛液太多貨內(nèi)壁不清潔，造成加樣量不準(zhǔn)。
2、恒溫箱溫度不是37℃（或43℃），或多塊反應(yīng)板重疊放置造成板孔內(nèi)的實際溫度偏差，使抗原、抗體復(fù)合物形成過少。
3、保溫時間不足，抗原、抗體反應(yīng)不*
4、顯色劑加入量不足。
5、顯色液的A、B液比例不對。、
6、洗滌時沖擊力過大，洗滌液浸泡時間太長，洗滌次數(shù)增加，導(dǎo)致已形成的抗原、抗體復(fù)合物洗脫。
7、底物反應(yīng)的溫度不夠，時間不足。
8、試劑盒在運輸、保存期間放置的溫度太高、時間過長，造成抗原、抗體效價下降，酶的活力降低。
9、試劑盒已超出保存有效期，抗原、抗體效價下降，酶活力降低。
二、ELISA試驗中結(jié)果出現(xiàn)白板、陽性對照不顯色的原因
1、洗滌液配制有誤。
2、終止液誤作為濃縮洗滌液或酶結(jié)合物稀釋液使用。
3、漏加酶結(jié)合物，物價酶結(jié)合物或在酶標(biāo)二抗的試驗中實驗順序錯誤。
4、終止液當(dāng)做底物緩沖液使用
5、配制溶液中殘留了解滅火酶活力的物質(zhì)。
6、底物中未加OPD或TMB。
7、運輸、貯存不當(dāng)，導(dǎo)致沒活力喪失。
8、底物液中未加過氧化氫或放置過久過氧化氫失效。
三、而莉薩是嚴(yán)重結(jié)果全部顯色的原因
1、酶結(jié)合物的濃度過大
2、恒溫箱溫度較高，酶結(jié)合物光片時間或底物顯色時間過長。
3、洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留或酶結(jié)合物殘留。
4、底物配置時間過久，底物受光照射時間較長或被污染。
5、整批樣品放置時間過長被污染或生長細(xì)菌。
6、一夜醉從復(fù)使用時，未清洗干凈或消毒不*
7、配制溶液的水質(zhì)有問題。
四、ELISA試驗中結(jié)果陰、樣對照顯色差距較小的原因
1、稀釋不準(zhǔn)。加樣量不準(zhǔn)。
2、加樣時個*被污染
3、底物不新鮮，配制時間較長或被污染。
4、試劑效價下降或超過了試劑的有效使用期。
5、配制溶液的水質(zhì)有問題
五、ELISA試驗中結(jié)果重復(fù)性不好的原因
1、樣品加入量多少不一，加樣時間又長又短。
2、樣品加入后為充分混合均勻。
3、移液加樣器加樣量不一致。
4、酶標(biāo)儀濾光片不對。
5、操作過程中個別反應(yīng)孔中液體外濺。
6、不同批號試劑混用。
7、瓶蓋交叉使用
8、溫育條件和保溫時間不一致。
9、洗滌條件不一致。
10、顯色條件和時間不一致。
11、邊緣效應(yīng)，導(dǎo)致周邊孔（尤為4個較）較*孔顯色為深。
12、將酶結(jié)合物或底物溶液加載了孔壁上，并有殘留。
13、酶結(jié)合物充分混勻就加入反應(yīng)孔中。
14、多加或少加了酶結(jié)合物、底物。
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