液相色譜法是以液體作為流動相,并采用顆粒極細(xì)的固定相的柱色譜分離技術(shù)。液相色譜對樣品的適用性廣,不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中,可用氣相色譜分析的約占20%,而80%則需用液相色譜來分析。液相色譜根據(jù)分離機(jī)理的不同可分為液液分配色譜、液固吸附色譜、離子交換色譜和排斥色譜(或凝 膠滲透色譜)。液相色譜已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的含量測定、組成分析、質(zhì)量控制等方面。 近年來液相色譜法在藥物分析中占主要地位。據(jù)美國藥典22版載,HPLC在含量測定方法中位居*。其特點是分析速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、檢測自動化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡單 。本文在按在藥物分析中的作用從以下幾個方面綜述了液相色譜法在藥物分析的研究進(jìn)展。
1、在天然藥物及復(fù)方成藥分析中的應(yīng)用
ELSD能夠測定沒有紫外吸收或為紫外末端弱吸收的樣品，天然產(chǎn)物中的許多成分無疑找到了直接、準(zhǔn)確的測定方法。ELSD在天然產(chǎn)物及其復(fù)方成藥分析中的應(yīng)用報道主要有皂苷類、生物堿類、萜類內(nèi)酯等。皂苷無紫外吸收或僅為末端吸收，ELSD能夠?qū)ζ洳唤?jīng)衍生進(jìn)行檢測，在HPLC—ELSD的應(yīng)用中這方面的報道zui多。主要有一次性分離分析天然人參、生脈散復(fù)方、育精膠囊中的多種人參皂苷；西洋參中的人參皂苷和擬人參皂苷定量測定；三七中的三七皂苷的含量分析；黃芪、*和保元湯中的黃芪皂苷、黃芪甲甙的分離和測定；麥冬中的甾體皂甙元；天麻中的天麻甙的含量測定等。這些研究主要采用Cl8柱、乙晴與水作流動相，不經(jīng)衍生直接測定多組分含量，結(jié)果顯示方法靈敏度高(一般檢測限低于3μg／m1)、線性關(guān)系良好。對于無紫外吸收的生物堿類成分，ELSD同樣顯示出操作簡單、靈敏度高的優(yōu)點。對比HPLC—UV法測定貝母中的甾類貝母生物堿，采用ELSD檢測器，不但不需衍生化操作，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度，而且可檢測出不含雙鍵的貝母甲素，對動物體內(nèi)的生物堿類成分如河豚du素，無紫外吸收且安全性低，不適合衍生化法，可用ELSD法進(jìn)行檢測，獲得滿意結(jié)果。銀杏作為一種保健藥品，其主要活性成分為黃酮類和萜類內(nèi)酯，以往銀杏中的萜類內(nèi)酯成分主要采用HPLC—UV法和HPLC—RI測定，但由于萜類內(nèi)酯紫外吸收差，又含少量物質(zhì)的干擾，結(jié)果穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較差．隨著ELSD的發(fā)展和普及，這些方法已經(jīng)逐漸被ELSD法所取代。
2、液相色譜在抗生素分析中的應(yīng)用
HPLC—ELSD早在20世紀(jì)九十年代就用于天然產(chǎn)物分析，隨著技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范圍已逐漸擴(kuò)大，近年來屢有用HPLC—ELSD分析抗生素類藥物的報道，HPLC—ELSD分析抗生素類藥物的報道多見于氨基糖苷類抗生素、氨基糖苷類抗生素是臨床上常用的抗生素，可通過微生物發(fā)酵或半合成制得，是一類單組分或多組分糖基取代的氨基環(huán)醇類化合物，主要有：*、*、*、*、*等。對這一類抗生素的含量測定多采用微生物法，但微生物法測定的是各活性組分的總量，無法反映各組分組成。為克服這個缺點，國內(nèi)外的藥典采用HPLC法進(jìn)行測定，但這類抗生素?zé)o紫外吸收，只能采取衍生化法(多為柱前衍生)，結(jié)果易受衍生化反應(yīng)條件的影響而不夠準(zhǔn)確，ELSD法很好地解決了這個問題。氨基糖苷類抗生素含多個氨基，可產(chǎn)生含不同當(dāng)量無機(jī)酸鹽產(chǎn)品，對于這些副產(chǎn)物成分，ELSD也能很好的加以測定。
3、液相色譜作為常規(guī)分析方法在藥物分析中的應(yīng)用
液相色譜法作為藥物分析中的zui主要的分析方法,常被作為常規(guī)分析和檢驗方法。近年來在這個方面的研究比較多,劉樹業(yè)等為時刻監(jiān)控治療肝癌時的抗癌藥物劑量即血中的藥物濃度,提高療效,減少副作用,采用紫外-HPLC法對血中和組織中的*濃度進(jìn)行分析.用UV-240紫外分光光度計,BECKMAN332型液相色譜儀,采用反向色譜法。針對近幾年奧委會醫(yī)學(xué)委員會公布的禁用表中新增藥物及一系列利尿劑的相關(guān)化合物進(jìn)行了研究,比較了不同的提取方法及回收率,研究了幾種藥物的排泄情況;建立了同時分析13種利尿劑的液相色譜測定方法,檢出限小于5ng。用0.02mol/L的三羥甲基胺基甲烷(用磷酸調(diào)pH值至7)和甲醇(含2%乙酸和0.25%庚烷磺酸鈉)作流動相進(jìn)行梯度洗脫,建立了脂性油膏藥物中黃芩甙含量的反相液相色譜分析方法,本法分析速度快,重現(xiàn)性好,黃芩甙的平均回收率為103.7%。
4、液相色譜 - 熒光衍生法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用
體內(nèi)藥物分析是在大量復(fù)雜組分中進(jìn)行微量或超微量藥物及代謝產(chǎn)物的測定。體內(nèi)藥物分析zui常用的檢品是血樣(血漿、血清、全血)、尿樣、唾液及組織液, 特殊情況下也采用乳汁、淚液、膽汁、羊水、糞便等[1]。隨著藥物的開發(fā)研究, 藥物的服用劑量越來越小, 體內(nèi)藥物的濃度越來越低, 這對分析方法靈敏度和選擇性等都提出很高的要求[2]。液相色譜法具有準(zhǔn)確、靈敏度、專一性強(qiáng)等特點, 一直是體內(nèi)藥物分析的主要手段[3]。而液相色譜的熒光檢測器比紫外吸收檢測器靈敏度高。具有強(qiáng)紫外吸收的化合物檢測靈敏度可達(dá) ng水平, 而熒光衍生物一般的檢測水平為 10-12～10-14m ol/L,靈敏度比紫外檢測器提高 10～1000 倍[4]。故 H PLC 法結(jié)合熒光檢測法所具有的較高的選擇性及靈敏度以及試樣用量少的特性, 使得對復(fù)雜生物樣品中藥物及其代謝物的測定變得更加靈敏、準(zhǔn)確、快速。但熒光檢測器要求被檢測樣品能被激發(fā)產(chǎn)生熒光. 對于不產(chǎn)生熒光或熒光較弱的樣品靈敏度很低, 甚至不能檢測。為了擴(kuò)大檢品范圍, 提高檢測靈敏度, 常采用熒光衍生法。熒光衍生法是指在一定條件下利用某種試劑與樣品中待測組分相作用, 使其產(chǎn)物具有熒光或熒光增強(qiáng)。另外,熒光檢測器選擇性好, 過量的試劑和副產(chǎn)物往往不產(chǎn)生干擾, 衍生物亦不必純化, 因此熒光衍生技術(shù)的采用, 擴(kuò)大了液相色譜 - 熒光測定法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用范圍, 為藥物代謝動力學(xué), 臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)等研究提供科學(xué)依據(jù)。
5、液相色譜在藥物殘留測定上的應(yīng)用
由于液相色譜能夠?qū)繌?fù)雜組分進(jìn)行定量分析,被廣泛使用于藥物殘留的測定上。以液相色譜法建立了豬、羊、雞肝組織中西維因殘留量的檢測方法。采用ODS色譜柱,二極管陣列檢測器,甲醇/水(65/35)為流動相,222nm檢測波長下進(jìn)行檢測。西維因?qū)φ掌啡芤旱膠ui低檢測限為0.1mg/L,線性范圍為0.1～20mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-22459.83+454684.31x,線性關(guān)系良好(r=0.9999)。樣品以乙腈提取,并加入*和正已烷,過濾后去除雜質(zhì),乙腈層在45～50℃下水浴氮?dú)獯蹈?殘渣用甲醇溶解后,進(jìn)樣分析。平均回收率均大于80%,日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。符合藥物殘留痕量分析要求。研究了動物源性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的提取、凈化和液相色譜分析條件,建立了液相色譜法測定動物性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留的方法,該法檢測限0.025mg/kg,回收率為84%～98%。此外,在人血中藥物含量的測定中也有很多的應(yīng)用。建立了血漿及尿液中異煙肼的液相色譜快速測定方法,以滿足臨床藥物分析和法醫(yī)學(xué)鑒定的需要,提高對血漿及尿液中異煙肼濃度檢測的準(zhǔn)確性。以*為衍生化試劑,將異煙肼經(jīng)柱前衍生為異煙肼*腙,直接對處理后樣品中的腙進(jìn)行定性、定量分析。以在空白人體液樣本中定量添加標(biāo)準(zhǔn)異煙肼的方法考察了樣品的前處理方法、儀器條件、線性范圍、精密度、回收率等,并對健康受試者血液中的異煙肼濃度進(jìn)行了監(jiān)測。
液相色譜法由于分析速度快、分離效率高、檢測靈敏度高、檢測自動化、適用范圍廣、組分易回收、樣品處理較簡單等優(yōu)點在確定藥方案和治療劑量,以及藥物動力學(xué)分析和藥效學(xué)評價提供了方法的基礎(chǔ),有著廣泛的應(yīng)用前景。
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