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南京科捷檢測科技發(fā)展有限公司
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閱讀：1502發(fā)布時間：2018-5-22
塔板數是一個粗略的指標，不能作為評價色譜柱的標準。
通常使用塔板數來考察色譜系統(tǒng)：將新柱子接到儀器上，根據色譜柱生產商提供的測試條件測試該色譜柱，你應該得到和分析報告上同樣的結果。zui差也應該得到比報告值低10%的塔板數。如果你所測得的塔板數遠遠低于廠家提供的報告數據，這就說明你的色譜系統(tǒng)可能存在一些問題。進樣器、柱外效應、毛細連接以及檢測器都是容易出現(xiàn)問題的地方。
相信每個色譜工作者都會關心分辨率，分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度的指標。色譜的核心任務就是為了使每個峰完成分離，我們在實際工作中需要得到合理峰寬的窄峰以便獲得較低的檢測限(這已經不是什么難題，現(xiàn)在的色譜柱都可以達到這個要求)。
然而，我們需要考慮的另一個因素是塔板數對分辨率的影響僅僅是平方根的關系，這意味著當一根色譜柱的塔板數下降50%，分辨率僅僅下降7%。而當一根色譜柱塔板數下降為新柱子一半的時候，你肯定看到了其它更加嚴重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長了。其實，大多數用戶僅僅使用色譜柱塔板數的一小部分。例如，對一支新的150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱來講，廠家測試報告上的塔板數為14,000。使用下面的公式可以估算一支色譜柱的塔板數：
N=3000*L/Dp
L是色譜柱的柱長，以厘米為單位;Dp是填料的粒徑，以微米為單位
一支150mm×4.6mm，5mm粒徑的色譜柱的柱效大約為9000，比廠家測試數據低30%。在實際的工作中，大多數色譜方法僅僅需要這些塔板數的一半，這些色譜方法還有優(yōu)化的空間嗎?答案是肯定的。可見，色譜柱的塔板數不是分離中zui重要的參數。
較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態(tài)。壓力的測量是zui容易的，通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求：用新柱子時柱壓不高于2500psi，在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現(xiàn)代的液相色譜系統(tǒng)都可在更高的壓力下使用，但由于高壓產生的系統(tǒng)損耗和泄漏的問題會很嚴重。當壓力超過3000psi時，考慮更換進樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高，則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經被污染，這提示我們該換柱子了。有統(tǒng)計表明，超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。
分辨率是我們考察色譜柱的一個非常重要的指標，只要兩個組分可以獲得基線分離，對該分析物的定量就不會有什么問題。對于對稱的高斯峰來講，1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價指標的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。
另外一個考察色譜柱質量的標準是峰形拖尾情況，廠家測試報告的峰形都非常漂亮，但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。實際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。zui值得一提的是含有氮原子的化合物，這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結合非常緊密，隨著色譜柱使用時間越長，鍵合相流失，拖尾則更加嚴重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來?；诖?，zuihao定一個拖尾因子的上限，如美國藥典規(guī)定拖尾因子不超過1.8。
確定色譜柱“拋棄”標準的zuijia時間是當我們開發(fā)分析方法或作方法認證的時候。通常，在開發(fā)分析方法的過程中你會試驗幾根色譜柱，分析足夠多的實際樣品，你知道當分離變差的時候是什么樣的情況。我傾向于在開始時使用一個寬的范圍。我們的經驗是這樣的：你如果在開始時緊縮系統(tǒng)適用性要求，在方法認證后再放寬這個要求是很困難的。在分析實際樣品之前進行系統(tǒng)適用性考察，以確保該色譜方法滿足分析者可以接受的標準。
ps：附上維護色譜柱使用與維護的一些要點：
1、柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動，以免柱床產生空隙。
2、如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根柱，這樣有助于延長柱子的壽命。
3、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。
4、應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/span>
5、如使用柱溫控制裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。
6、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
7、選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一個預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
8、避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一個保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
9、經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
10、保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
11、色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進人柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
12、在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時對色譜分析系統(tǒng)進行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內的雜質。
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