1.烤片

烤片的目的是將帶有蠟的組織切片牢固地黏在載玻片上，以免染色過程中切片脫落。切片在56~60℃的恒溫箱中至少放置1小時才能達到此目的，但是，通常的烤片溫度為;8～60℃，時間為2~6小時。由于高溫干燥可加速組織中抗原的氧化，因此高溫烤片對抗原有破壞作用。

2.脫蠟和水化

分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15～30分鐘，以脫掉組織中的蠟。但是，進人組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶，故需進一步通過下行梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替代出來。切片在100%乙醇工、Ⅱ中分別浸泡5分鐘，95%、90%、80%和70%乙醇中分別浸泡2分鐘，PBS漂洗3次，每次3分鐘，置蒸餾水中待用。

3.抗原修復(fù)

上海信帆生物科技公司憑借的生物技術(shù)和嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系，專業(yè)代做免疫組化實驗 ，雄厚的技術(shù)力量做基礎(chǔ)，專業(yè)團隊做后盾，對免疫組化 提供100%的率熱情的技術(shù)服務(wù)。  
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4.細(xì)胞膜打孔

切片置于0.1%~0.3%TritonX-100中，室溫浸泡25分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。TritonX-100為去污劑，其脂溶性可使細(xì)胞膜穿孔，增加細(xì)胞膜對抗體的滲透性。檢測細(xì)胞膜抗原時可免去此步驟。

5.滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素

6.非免疫血清封閉

抗體能被組織切片中富有電荷的膠原和結(jié)締組織成分吸附。從而導(dǎo)致背景著色，為了防止這種現(xiàn)象發(fā)生，在特異性抗體處理切片之前，選擇與二抗種屬相同的非免疫血清封閉電荷，阻止一抗與之結(jié)合，抑制非特異性背景著色。常用方法是用2%～10%羊血清或2%～5%牛血清白蛋白在室溫下作用10~30分鐘。但應(yīng)注意此種結(jié)合不牢固，所以不要沖洗，傾去余液直接加一抗。SABC或SP免疫組織化學(xué)試劑盒中常配有非免疫血清。

7.*抗體孵育

滴加特異性一抗于切片上，4℃孵育24～48小時，或室溫孵育過夜，也可在37~C孵育1～2小時。之后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。一抗分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆抗體的抗原專一性較差，非特異性反應(yīng)較明顯，效價不太穩(wěn)定。但多克隆抗體制備簡便，價格低廉，抗體效價較高，稀釋度一般在1：100～1000之間，高者可達1：數(shù)萬。

利用單克隆抗體制備技術(shù)制備的單克隆抗體特異性強，無交叉反應(yīng)，質(zhì)量和效價穩(wěn)定，非特異性反應(yīng)較少，標(biāo)記結(jié)果可靠，在應(yīng)用中有更多的*性。但單克隆抗體制備復(fù)雜，價格昂貴，抗體效價較低，稀釋度在1：50～100。抗體的選擇是開展免疫組化染色zui重要環(huán)節(jié)之一。市場銷售的一抗大部分來源于國外，生物試劑廠家各異，因此，對購入的抗體首先要進行預(yù)實驗檢測。試劑公司在銷售抗體時附有說明書，包括抗體的來源、免疫球蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、使用流程和注意事項、洗滌時緩沖液的適宜離子強度和pH值等。市場銷售的一抗分為即用型和濃縮型兩種，對前者抗體的效價無需摸索，但對于濃縮型一抗，則應(yīng)摸索出*的工作效價，抗體濃度過高或過低都將可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，應(yīng)該以一個適當(dāng)?shù)南♂尪鹊玫?的抗原染色強度和zui低的背景著色。稀釋特異性抗體常用含1%～3%非免疫血清的PBS，需現(xiàn)配現(xiàn)用，稀釋后的一抗存放時間不可超過三天。

8.生物素標(biāo)記第二抗體孵育

滴加稀釋度合適(按說明書的稀釋度或預(yù)實驗摸索)的生物素標(biāo)記二抗于切片上，室溫孵育1小時，繼而PBS漂洗3次，每次5分鐘。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分，特異性要與一抗匹配，否則，一抗和二抗連接有誤可導(dǎo)致假陰性染色結(jié)果。例如，兔抗鼠或人的一抗需與抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需與抗小鼠的二抗匹配。目前，生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫組織化學(xué)試劑盒中，故無需考慮其濃度。

9.SABC-POD或SABC-AP孵育

滴加稀釋度合適(按說明書的稀釋度或預(yù)實驗摸索)的ABC-POD或SABC-AP于切片上，室溫孵育10~30分鐘，隨后PBS漂洗4次，每次5分鐘。SABC或SP試劑盒中的即用型試劑無需稀釋。

10.顯色

顯色是免疫組化染色的zui后關(guān)鍵步驟，一般過氧化物酶的檢測系統(tǒng)選用DAB或AEC顯色。前者顯色為棕色，后者為紅色。要得到*的顯色效果，必須在鏡下嚴(yán)格控制，以檢出物達到zui強顯色效果而背景五色為終止點。根據(jù)經(jīng)驗，DAB在配制后zui長放置時間是30分鐘以內(nèi)，過時則不能使用，DAB滴加到組織切片時作用時間zui長不宜超過10分鐘(在5分鐘內(nèi))，否則不管有無陽性結(jié)果均應(yīng)終止反應(yīng)。對一些富含內(nèi)源性酶的組織用DAB顯色時極易出現(xiàn)背景色，應(yīng)盡早在鏡下控制，以達到*分辨效果。DAB有致癌作用，故操作時應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時洗手，接觸DAB的實驗用品經(jīng)洗液浸泡24小時后方能再次使用。AEC顯色系統(tǒng)的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應(yīng)以水性封片劑為主，故染色切片不能保存。免疫酶染色時，酶底物濃度的增加或孵百盯面雨延長，均可增強染色強度。過氧化物酶顯色時，H2O2濃度使顯色反應(yīng)過快而致背景加深，且過量H2O2能抑制酶的活性，故H2O2濃度要適中。

如果上述步驟使用鏈霉親和素―生物素―堿性磷酸酶復(fù)合物，則需選用NBT/BCIP作為顯色系統(tǒng).陽性結(jié)果為藍黑色。顯色后蒸餾水或自來水沖洗。采用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物底物時，染色過程中的緩沖液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)較好。

11.蘇木精復(fù)染細(xì)胞核

為使組織切片清晰的顯示組織結(jié)構(gòu)，便于準(zhǔn)確定位，常對切片進行復(fù)染。zui常使用的細(xì)胞核染料為蘇木精，也可根據(jù)情況使用甲基綠和核快紅。染色約10秒，鏡下控制著色程度，效果好時自來水沖洗返藍。

12.封片

如果選用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度乙醇脫水(80% 乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘)，乙醇Ⅰ和100%Ⅰ乙醇Ⅱ各5分鐘，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明5分鐘，zui后中性樹脂封固;如果選用AEC顯色，則切片不能經(jīng)乙醇脫水，沖洗后拭干直接用水性封片劑封片。