豬瘟病毒抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit (CSFV Ag)

用途

HerdChek 豬瘟病毒抗原檢測(cè)試劑盒/血清,是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計(jì)的、用于檢測(cè)血清、血漿中豬瘟病毒抗原的一種診斷試劑盒。

概述

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）, 邊界病毒（Border Disease Virus BDV）和豬瘟病毒（CSFV）是同屬于黃病毒科瘟病毒屬的3 個(gè)成員。豬瘟由于其高度的病原性和廣泛的致死性，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的損失。感染高致病力豬瘟病毒后，豬在出現(xiàn)癥狀前會(huì)排出大量的病毒。耐過(guò)急性或亞急性的感染的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會(huì)造成豬的慢性的感染，病豬將會(huì)持續(xù)或間歇排出病毒直至死亡。

懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過(guò)胎盤感染胎兒。先天性的感染可能導(dǎo)致流chan，木乃伊胎兒，死產(chǎn)和/或弱仔及畸形胎兒。豬也有可能感染BVDV 或BDV，盡管這些感染通常呈溫和經(jīng)過(guò)并且是自限性的,而且很難檢測(cè)到病毒。HerdChek CSFV 抗原檢測(cè)試劑盒對(duì)瘟病毒屬病毒有*的敏感性，不能區(qū)分BVDV 或BDV 抗原，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果需要用CSFV 特異的方法確認(rèn)。

此試劑盒只用于獸醫(yī)體外診斷。

原理

HerdChek 豬瘟病毒抗原/血清是為檢測(cè)血清和血漿樣品中的豬瘟病毒抗原(Ag)設(shè)計(jì)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。這個(gè)微量滴定的形式是將豬瘟病毒(Erns)的單克隆抗體包被于微量板上裝配而成的。樣品中的豬瘟病毒抗原被捕獲在板子上。在將檢測(cè)樣品于微孔中孵育之后，捕獲的豬瘟病毒抗原由瘟病毒特異性抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)。然后，沒結(jié)合的酶標(biāo)記物被洗掉，再加入底物和/色原體溶液。在酶的存在下，底物轉(zhuǎn)化為可以與色原體發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物并產(chǎn)生藍(lán)色。在加了終止液之后，產(chǎn)生黃色。用分光光度儀檢測(cè)在450 nm [A(450)]下的單波長(zhǎng)或者450 nm 和 650 nm [A(450/650)]雙波長(zhǎng)下的吸光值。樣品的校正OD 值由檢測(cè)樣品得到的吸光值和陰性對(duì)照的校正吸光值來(lái)計(jì)算

試劑

   所有試劑要保存在2－8℃。

   1. Ems 單克隆抗體包被的微量反應(yīng)板 2 板 5 板

   2. 陽(yáng)性對(duì)照1.6 ml 2 ml

   3. 陰性對(duì)照1.6 ml 2 ml

   4. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物25 ml 60 ml

   5. 檢測(cè)抗體 15 ml 30 ml

      A. 10 倍濃縮洗滌液125 ml 480 ml

      B. TMB 底物溶液20 ml 60 ml

      C. 終止液20 ml 60 ml

自備器材

    ·的吸管或微量移液器，用來(lái)吸取10～1000微升(μl)的液體。

    ·微量移液器使用的吸頭。

    ·用來(lái)稀釋洗滌液的500ml量筒。

    ·適用96孔微量反應(yīng)板的酶標(biāo)儀。

    ·蒸餾水或去離子水。

    ·滴加和吸去洗滌液的設(shè)備

    ·可以盛裝液體和消毒液的容器

    ·溫箱或封板器

    ·振蕩器

注意事項(xiàng)

   ·把它當(dāng)作潛在的傳染源來(lái)處理所有的生物材料。

   ·禁用嘴吸液。

   ·處理樣品和試劑盒的地方禁止飲食和吸煙。

   ·底物溶液對(duì)眼睛、皮膚以及呼吸系統(tǒng)都有刺激作用，在使用過(guò)程中要防止該溶液接觸眼睛和皮膚。

   ·終止液中含有1M HCl,容易引發(fā)燒傷。要小心處理。

   ·避免底物TMB照到強(qiáng)光，或接觸到氧化劑。盛裝TMB溶液的容器要用干凈的玻璃或塑料器皿。

   ·所有試劑一律放置2-8℃ 保存。所有試劑用前恢復(fù)至室溫18-25℃，用完后返回到2-8℃以便下次使用。

   ·用過(guò)的材料要無(wú)害化處理。

   ·使用處理各個(gè)試劑時(shí)要小心操作，嚴(yán)防對(duì)試劑的污染。

   ·不要使用過(guò)期的試劑盒；禁止非同批試劑盒混用。

   ·嚴(yán)格按照操作程序，仔細(xì)地吸液、計(jì)時(shí)、充分洗滌，對(duì)于獲得和準(zhǔn)確的結(jié)果是非常必要的。

   ·每次檢測(cè)均要加做2個(gè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

   ·在檢測(cè)中，試劑的準(zhǔn)備應(yīng)用雙蒸水或去離子水配制。

   ·沒有用完的微量反應(yīng)板應(yīng)貯存在密封塑料袋內(nèi)，于2-8℃存放。

   ·僅供獸醫(yī)。

試劑準(zhǔn)備

洗滌液制備

10 倍濃縮的洗滌液在使用前必須讓它恢復(fù)到室溫，使用時(shí)要搖勻使析出的鹽溶解，并用蒸餾水或去離子水進(jìn)行10 倍稀釋（如:30ml 的濃縮洗滌液要加270ml 的水并充分混勻）。無(wú)菌條件下制備的洗滌液在2-8℃可保存1 周。

樣品準(zhǔn)備

   血清和血漿(新鮮或凍結(jié))都可用于檢測(cè)。

操作步驟

   在使用之前，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到室溫（18－25℃）。試劑應(yīng)通過(guò)輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混合均勻。

每個(gè)樣本都使用不同的吸頭。

   1. 取出用抗體包被的微量反應(yīng)板，并在紀(jì)錄表上標(biāo)記好每個(gè)樣本的位置。

   2. 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入50μl 的檢測(cè)抗體?？梢杂靡埔浩鳎?/span>8 或12 道）加樣。

   3. 在陰性對(duì)照的雙孔中各加50μl 陰性對(duì)照。

   4. 在陽(yáng)性對(duì)照的雙孔中各加50μl 陽(yáng)性對(duì)照。

   5. 在剩下的反應(yīng)孔中分別加入50μl 被檢樣品。對(duì)于不同的被檢樣品要更換吸頭。

   6. 輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，將反應(yīng)板中的溶液混勻。

   7. 在37℃的條件下孵育2 小時(shí)，也可在2－8℃的條件下孵育過(guò)夜（12-18 小時(shí)于冰箱中）。在孵育過(guò)程中應(yīng)將微量反應(yīng)板封閉或在濕盒內(nèi)孵育，以防反應(yīng)孔中的液體蒸發(fā)。

   8. 吸出反應(yīng)孔中的液體物質(zhì)并棄入廢液缸中。

   9. 每個(gè)反應(yīng)孔加入約300μl 的洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌五次。每次洗滌后吸出所有孔中的液體。在洗滌時(shí)以及在加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物之前要防止反應(yīng)板出現(xiàn)干燥現(xiàn)象。在zui后一次洗滌完后，將反應(yīng)板在吸水

性強(qiáng)的物質(zhì)上拍干。

   10. 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物。

   11. 在室溫下（18－25℃）孵育30 分鐘。

   12. 重復(fù)步驟8 和9。

   13. 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μlTMB 底物。

   14. 在室溫（18－25℃）條件下于黑暗處孵育10 分鐘。在加完*個(gè)孔后開始計(jì)時(shí)。

   15. 在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl 的終止液終止反應(yīng)。在加終止液時(shí)要按第13 步的順序進(jìn)行滴加。

   16. 將酶標(biāo)儀在空氣中調(diào)零。

   17. 于450nm 單波長(zhǎng)或450nm 和650nm 雙波測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光值。

   18. 計(jì)算結(jié)果。

結(jié)果

   陽(yáng)性對(duì)照OD 的平均值（PCx）與陰性對(duì)照OD 的平均值（NCx）之差（P-N）必須大于或等于0.150OD，另外陰性對(duì)照OD 的平均值（NCx）必須小于或等于0.250 OD，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果才算成立。

   若試驗(yàn)結(jié)果失敗，有可能是實(shí)驗(yàn)操作失誤造成，應(yīng)按操作說(shuō)明進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

   判斷各樣品是否含有待測(cè)抗原主要通過(guò)計(jì)算修正OD 值（S-N）來(lái)決定的。