原位雜交（FISH、IF雙染）

服務(wù)介紹：

原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知序列核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。IF即免疫熒光，可檢測(cè)組織或細(xì)胞中某蛋白的表達(dá)情況及定位。

原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測(cè)靶基因與靶蛋白的共定位情況。

實(shí)驗(yàn)流程：

石蠟切片熒光探針原位雜交與免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)步驟

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫(huà)圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°C消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過(guò)夜。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9、孵育一抗：滴加一抗，PBS稀釋。4°過(guò)夜。后PBS洗3×5min。

10、孵育二抗：滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育50min。后PBS洗3×5min。

11、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

12、鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm,發(fā)藍(lán)光;FAM(488)綠光激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光。) 　　

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰，盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運(yùn)輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運(yùn)輸；

4、細(xì)胞爬片：細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無(wú)酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。 

單據(jù)填寫(xiě)：

1、探針合成：需提供待測(cè)目的基因序列或基因登錄號(hào)、所需標(biāo)記類型；

2、自帶探針需告知完整探針信息；

3、寫(xiě)明檢測(cè)要求。