本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿及相 關液體樣本中高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)水平。用純化的小 鼠高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加 入高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)，再與 HRP 標記的羊抗鼠抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體 復合物，經過*洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸 的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠高遷移率族蛋白 B1(HMGB1)呈正相 關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中小鼠高遷移 率族蛋白 B1(HMGB1)濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48 孔配置 | 96 孔配置 | 保存 |
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說明書 | 1 份 | 1 份 | |
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封板膜 | 2 片（48） | 2 片（96） | |
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密封袋 | 1 個 | 1 個 | |
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酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
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標準品：18μg/L | 0.5ml×1 瓶 | 0.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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標準品稀釋液 | 1.5ml×1 瓶 | 1.5ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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酶標試劑 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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樣品稀釋液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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顯色劑 A 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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顯色劑 B 液 | 3 ml×1 瓶 | 6 ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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終止液 | 3ml×1 瓶 | 6ml×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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濃縮洗滌液 | （20ml×20 倍）×1 瓶 | （20ml×30 倍）×1 瓶 | 2-8℃保存 |
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樣本處理及要求：
- 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上 清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
- 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次 離心。
- 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程 中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
- 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/ 分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞 濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分
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鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
- 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?nbsp;用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器 將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待 檢測，其余冷凍備用。
- 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上 進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
- 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
- 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標 準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二 孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl， 混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各 取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混 勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準 品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，
濃度分別為 12μg/L，8μg/L ，4μg/L，2μg/L， 1μg/L）。
- 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣 品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣 品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混 勻。
- 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
- 配液：將 30（48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
- 溫育：操作同 3。
- 洗滌：操作同 5。
- 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
- 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
- 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止 液后 15 分鐘以內進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間 控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值 大于標準品孔*孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計 算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
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6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋 倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標 準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值為 0.92 以上。
2.批內與批間應分別小于 9%和 15%
檢測范圍：
0.75μg/L -15μg/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6 個月
