注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義
超氧陰離子自由基作為生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種自由基，可攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、
蛋白質(zhì)、核酸和聚不飽和脂肪酸等，使其交鏈或者斷裂，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機(jī)
體衰老和病變有很密切的關(guān)系，清除超氧陰離子自由基的研究已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。
測(cè)定原理
AP-TEMED 系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子，與鹽酸羥胺反應(yīng)生成 NO2－，NO2－與對(duì)氨基苯磺酸和 α－
萘胺的作用生成紅色的偶氮化合物，在 530nm 處有特征吸收峰，樣品對(duì)超氧陰離子的清除
能力與 530nm 的吸光值呈負(fù)相關(guān)。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加 8mL 蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑五：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500
萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，
總時(shí)間 3min）；然后 4℃，10000g 離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。
4. 粉劑藥物可配制成相同濃度，比如 1mg/mL。
| 空白管 | 對(duì)照管 | 測(cè)定管 |
試劑一（μL） | 40 | 40 | 40 |
試劑二（μL） | | 160 | 160 |
H2O（μL） | 260 | 100 | |
充分混勻，25℃反應(yīng) 1min |
樣品（μL） | | | 100 |
試劑三（μL） | 200 | 200 | 200 |
充分混勻，37℃反應(yīng) 30min |
試劑四（μL） | 200 | 200 | 200 |
試劑五（μL） | 200 | 200 | 200 |
充分混勻，37℃顯色 20min，于 1mL 玻璃比色皿，以空白管調(diào)零，在 530nm 處測(cè)定對(duì)照管 和測(cè)定管的吸光值，分別記為 A 對(duì)照管和 A 測(cè)定管。 |
計(jì)算公式
超氧陰離子清除率 I%=
A對(duì)照管 - A測(cè)定
A對(duì)照管
´100%
注意事項(xiàng)
1. 試劑一 4℃可保存 2 個(gè)月，配制好的試劑二 4℃可保存一周，建議實(shí)驗(yàn)前配制，并盡快
使用。
2. 樣品處理完后立即進(jìn)行測(cè)定，或者低溫保存不超過(guò) 24 小時(shí)。
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