實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 IPTGNiSO4蛋白酶抑制劑MCAC-EDTATriton
儀器、耗材 層析柱轉(zhuǎn)子
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 接種含以pET載體表達(dá)帶*尾融合蛋白的大腸扦菌BL21（DE3）pLyaS菌株于10 ml M9ZB/氨芐*/*培養(yǎng)基。于37℃搖蕩培養(yǎng)。
2. 轉(zhuǎn)接1 ml 過培養(yǎng)物于100 ml M9ZB/氨芐青霉索/*培養(yǎng)基，于37℃揺蕩培 養(yǎng)至OD600=0.7~1.0。
3. 加入1 ml 0.1 mol/l IPTG，干37℃繼續(xù)培養(yǎng)1~3 h。
4. 4 400 g 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-70℃。
往一根1.5 cm×10 cm 層析柱中加入1 ml NTA介質(zhì)，讓液體剛好流至柱床的頂部， 用下列液體洗柱：
0.5 ml （3個(gè)床體積）去離子水
0.5 ml （5個(gè)床體積）50 mmol/l NiSO4·6H2O
0.5 ml MCAC-0緩沖液
6. 將菌體沉淀置于冰浴中凍融，加入5 ml MCAC-0緩沖液和33 μl 150×蛋白酶抑制劑混合液。用吸管吹打重懸，超聲破菌或勻漿。
7. 加入0.05 ml 10%（w/v）Triton X-100溶液（至終濃度0.1%）充分混勻，在 -70℃凍結(jié) 10 min。
8. 在冰浴中凍融細(xì)胞懸液。于260 000 g 離心60 min，將上清吸至在冰浴中的干凈容器，棄沉淀。取10 μl 小份樣品凍結(jié)于-70℃，留待以后分析之用
9. 如果提取液被凍結(jié)，在冰上凍融，以10~15 ml/h 的流速上Ni2+-NTA柱。收集流出液，保留待進(jìn)行SDS-PAGE分析。
10. 以20~30 ml/h 的流速用5 ml MCAC-0緩沖液洗柱，棄流出液。
11. 以分段冼脫的方式分別依次用5 ml 下列緩沖液冼柱：MCAC-20、MCAC-40、MCAC-60、MCAC-80、MCAC-100、MCAC-200、MCAC-1000。分部收集每1 ml 洗脫液，保留待SDS-PAGE分析。
12. 在10~15 ml/h 的流速下以5 ml MCAC-EDTA緩沖液洗柱，收集毎1 ml 級(jí)分。
13. 分析各級(jí)分中所含的冼脫蛋白。
14. 合并含洗脫蛋白質(zhì)的級(jí)分，取出10 μl 用SDS-PAGE分析。必要時(shí)，透析除去MCAC緩沖液。將樣品分成小份，在-70℃或液氮中凍結(jié)。
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 GuMCAC-EDTA緩沖液鹽酸胍
儀器、耗材 轉(zhuǎn)子離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 制備表達(dá)帶*尾的融合蛋白的大腸桿菌菌體沉淀。
2. 準(zhǔn)備NTA介質(zhì)層析柱，但柱子zui后以GuMCAC-0緩沖液洗滌.
3. 在冰浴中凍融菌體沉淀。加5 ml GuMCAC-0緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲破菌或勻漿。在-70℃凍結(jié)10 min，室溫凍融。
4. 用振搖器、旋轉(zhuǎn)混合器或磁力攪拌器輕柔地混勻樣品60 min，在4 ℃ 27 000 g 離心30 min 將上清吸至一個(gè)干凈的容器并棄沉淀。取10 μl 小份樣品留待SDS-PAGE分析。
5. 如果提取液被凍結(jié)，室溫凍融，以10~15 ml/h 的流速上Ni2+-NTA柱。收集流出液，取10 μl 小份樣品留待SDS-PAGE分析。
6. 以20~30 ml/h 的流速用5 ml GuMCAC-0緩沖液洗柱，棄流出液。
7. 以分段冼脫的方式分別依次以5 ml 下列緩沖液冼柱：GuMCAC-20、GuMCAC-40、GuMCAC-60、GuMCAC-80、GuMCAC-100、GuMCAC-500。分部收集每1 ml 洗脫液，保留待SDS-PAGE。
8. 在10~15 ml/h 的流速下以5 ml GuMCAC-EDTA緩沖液洗柱，收集每1 ml 級(jí)分。
9. 確定含蛋白祥品的組分，合并之。將祥品透析或保存于-70℃。
10. 準(zhǔn)備合適的zui終蛋白溶解溶液（如用于蛋白質(zhì)切割斷裂或長(zhǎng)期保存），并加入鹽酸胍至4 mol/l 終濃度。在4℃對(duì)1 000 ml 該含4 mol/l 鹽酸胍的緩沖液透析2 h 以上。
11. 倒出500 ml 上述含胍的緩沖液，再加入不含胍的緩沖液，重復(fù)透析。
12. 將透析袋移至1 000 ml 不含鹽酸胍的新鮮緩沖液，4℃透析2 h 或。
13. 從透析袋中取出蛋白溶液，分裝成小份，在-70℃或液氮中凍結(jié)。
14. 分析各分部收集的級(jí)分并處理蛋白。
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