一、Bradford法
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)定量是相當(dāng)?shù)?，特別是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或*等。但是，去污劑的濃度超過0.2%則影響定量結(jié)果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。
1. Bradford染液配制：將100mg考馬斯亮藍(lán)溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補(bǔ)充至200ml，放4C至少6個月。
2. 作標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，例如進(jìn)行抗體定量，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 將待測樣本溶于100μl緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同；
4. 按1：5用雙蒸水稀釋濃染料結(jié)合溶液，過濾離心沉淀物；
5. 每個樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5-30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，即可在595nm光波長下測定其吸光度。注意，顏色反應(yīng)不得超過30min；
6. 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣本的濃度。
注意：應(yīng)用Bradford法測定BSA的值是其重量的兩倍。
二、Bradford斑點(diǎn)試驗(yàn)
該方法特別適用于檢測洗脫組分，以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強(qiáng)弱。
1. 首先，濃縮Bradford染液。將100mg考馬亮藍(lán)溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補(bǔ)充至200ml，放4C至少6個月。這種染液也可從Bio-Rad公司購到；
2. 將8μl待測蛋白質(zhì)樣本轉(zhuǎn)移至一 條Parafilm，Saran Wrap上或微孔板孔中。同時應(yīng)設(shè)一洗脫液樣本作為空白對照；
3. 每個樣本孔中加2μl濃Bradford染液并混勻；
4. 大約2min后，含有蛋白質(zhì)的樣本將變藍(lán)。該方法的靈敏度約為10μg/ml。此反應(yīng)對去污劑的濃度超過0.2%時非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2 或EDTA對其無影響，Tris對其僅有輕微的影響。
三、Coomassie 斑點(diǎn)試驗(yàn)
該方法特別適用于檢測洗脫組分以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強(qiáng)弱。
1. 裁剪3MM厚的Whatman 紙約4mm2 ；
2. 每個樣本點(diǎn)5μl于Whatman 紙上；
3. 自然干燥樣本或用電吹風(fēng)吹干斑點(diǎn)，約1min或更少；
4. 將紙塊浸入0.25%的考馬斯亮藍(lán)溶液中（考馬斯亮藍(lán)溶于10%的甲醇，7%醋酸中） 30min；
5. 將紙塊放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗滌3-5 min，然后干燥。
四、紫外分光度檢測法
蛋白質(zhì)紫外光吸光率是所有的蛋白質(zhì)定量方法中zui快的方法。通常在280nm光波長下讀數(shù)。其在280nm光波長下的zui大吸光率主要處決于*和*的存在。在205nm光波長的吸收也常用到。其在205nm光波長下的zui大吸光率主要處決于肽鏈，盡管氨基酸也有影響。另外，一個主要的優(yōu)點(diǎn)是在測定蛋白質(zhì)濃度時，樣本不會遭到損害。
1、純蛋白質(zhì)溶液：
① 在280nm光波長下讀取與適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^的吸光率；
② 對于抗體和BSA，可應(yīng)用下表計(jì)算其濃度對其他蛋白質(zhì)可粗約地估計(jì)：1個單位吸光率相當(dāng)于1mg/ml。
蛋白質(zhì) A280 (1mg/ml)
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA 0.7
2、含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液
① 在280nm和260nm或280nm和205nm光波長下讀取與適當(dāng)?shù)膶φ障啾容^的吸光率；
② 用下列等式粗略計(jì)算其濃度：
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= A205 /(27 + 120 A280/ A205 )
會員1.png)