大腸桿菌表達蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略?，F(xiàn)在，許多蛋白質(zhì)正在被發(fā)現(xiàn)而事先并不知道它們的功能，這些自然需要將蛋白質(zhì)分離出來后，進行進一步的研究來獲得。分析蛋白質(zhì)的方法學現(xiàn)已極大的簡化和改進。必須承認，蛋白質(zhì)純化比起DNA克隆 和操作來是更具有藝術(shù)性的，盡管DNA序列具有異乎尋常的多樣性(因而它是*適合遺傳物質(zhì)的)，但它卻有標準的物理化學性質(zhì)，而每一種蛋白質(zhì)則有它自己的由氨基酸序列決定的物理化學性質(zhì)(因而它具有執(zhí)行眾多生物學功能的用途)。正是蛋白質(zhì)間的這些物理性質(zhì)上的差異使它們得以能進行純化但這也意味著需要對每一種待純化的蛋白質(zhì)研發(fā)一套新的方法。所幸的是，盡管存在這種固有的困難，但現(xiàn)已有多種方法可以利用，蛋白質(zhì)純化策略也已實際可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的獲得已是相當普遍的事。可誘導表達系統(tǒng)特別是Studier等發(fā)展的以噬菌體T7RNA聚合酶為基礎(chǔ)的表達系統(tǒng)的出現(xiàn)使人們能近乎常規(guī)地獲得過表達(overexpression)，表達水平可達細胞蛋白的2%以上，有些甚至高達50%.
(一)試劑準備
采用T7· Tag Affinity Purification Kit
1. T7·Tag抗體瓊脂 。
2. B/W緩沖液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3. 0.137mM NaCl，1%吐溫-20，pH7.3。
4. 洗脫緩沖液： 0.1M檸檬酸，pH2.2。
5. 中和緩沖液：2M Tris,pH10.4.
6. PEG 20000.
(二)操作步驟
1.100ml 含重組表達質(zhì)粒 的菌體誘導后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。
2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結(jié)合T7·Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未結(jié)合蛋白。
6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml,洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr,中間換液數(shù)次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
(三)注意事項
蛋白在過層析柱前，要0.45μm膜抽濾，否則幾次純化后，柱子中會有不溶物。
