一、材料與儀器
30%丙烯酰胺溶液;1.5mol/L Tris-HCl分離膠緩沖液，pH8.8;1.0mol/L Tris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8;電泳緩沖液，pH8.3;10%SDS溶液;10%過(guò)硫酸銨溶液;樣品處理液;染色液;脫色液;電泳玻璃板，電泳電源架，電泳槽，電泳儀 等;蛋白Mark。
二、方法與步驟
1)分離膠和濃縮膠配制
按下表比例分別配制分離膠和濃縮膠：
表1 聚丙烯酰胺 組成
試劑：
體積( ml )
分離膠
濃縮膠
H2 O
2.8
3.4
Acrgl-bis
4.5
0.83
Tris-Hcl
2.5 ( pH8.8 )
0.63 ( pH6.8 )
SDS ( 10 %)
0.100
0.050
Ap ( 10 %)
0.100
0.050
TEMED
5 μ l
5 μ l
2)凝膠板的準(zhǔn)備
a)洗板：
將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗二塊玻璃板，然后用自來(lái)水洗凈，再用酒精將板擦干。
b)配板：
將二塊玻璃板疊放整齊，用夾子兩邊夾好，下沿兩邊角可用凡士林封住縫隙，將這二塊玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下緣劃線，指示灌膠位置。拔去梳子。
3)灌膠
a)分離膠：
在分離膠的配置燒杯中按表2-7 加料，混勻后利用滴管將分離膠(避免氣泡產(chǎn)生)滴入二塊玻璃板之間，至液面達(dá)到梳子下緣1cm 處。用滴管緩慢加入水，注意不要沖亂膠面。靜置，待分離膠聚合后，倒去或用濾紙吸去水層。
b)濃縮膠：
在濃縮膠的配置燒杯中按配比加料，混勻后即刻用滴管加濃縮膠(避免氣泡產(chǎn)生)覆于二塊玻璃板之間的分離膠之上至滿，輕輕插入梳子。靜置待其凝結(jié)后，即制成凝膠板。用筆在梳子形成的凝膠凹口部位作好記號(hào)，指示樣品點(diǎn)入時(shí)位置。
4 )樣品處理
取樣：2ml (2 管，1ml / 管)
a )工程菌：誘導(dǎo)前培養(yǎng)2.5h 每瓶加入180μl 的IPTG 誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)2h 取樣： 2ml (2 管，1ml / 管)
b )樣品6000 轉(zhuǎn)離心10 min ，收獲包含體
c )*倒干，誘導(dǎo)前樣品：一管中加入30μl 雙蒸水，打散后加入另一管中，打散;
d)誘導(dǎo)后樣品：一管中加入50μl 雙蒸水，打散后加入另一管中，打散
e )等體積加loading buffer ：誘導(dǎo)前加30μl ,誘導(dǎo)后加50μl
f )沸水浴10 min ，煮完后以15000 轉(zhuǎn)離心10 min ，取上清液走電泳
g )對(duì)照菌同樣操作
h )樣品及mark 和loading buffer 都各取15μl 點(diǎn)樣，點(diǎn)樣順序按;對(duì)照菌誘導(dǎo)后、對(duì)照菌誘導(dǎo)前、工程菌誘導(dǎo)前、工程菌誘導(dǎo)后，一起走電泳的兩組間點(diǎn)mark ，zui右邊的泳道點(diǎn)loading buffer ，走SDS ―聚丙烯酰胺凝膠電泳
1)電泳
a)將二塊玻璃板制成的凝膠板上的夾子卸去，擦掉下沿兩邊角的凡士林。
b)將凝膠板垂直靠在電泳槽里的電源架上，使凝膠板的凹沿面靠向電源架。通常兩塊凝膠板共用一個(gè)電源架。
c)將凝膠板與電源架按要求固定于電源槽內(nèi)。按要求加入電泳緩沖液，使分別加入在兩塊凝膠板中間電源架內(nèi)的電泳緩沖液與加入在電泳槽中的電泳緩沖液互不相通。輕輕地拔去凝膠板內(nèi)的梳子。
d)取處理后的樣品液，用微量進(jìn)樣器吸取適量樣品液，將樣品液緩緩加入凝膠板內(nèi)地凹口部位(樣品點(diǎn)入處)。注意不要沖散樣品。
e)用二根導(dǎo)線連接電泳槽與電泳儀，注意紅色與黑色電極的插頭和插口相配。接通電源。控制電壓在濃縮膠中為70 ― 80V ，這次實(shí)驗(yàn)我們控制在75V ，走過(guò)濃縮膠后電壓調(diào)為120V 。電泳時(shí)觀察凝膠板上的樣品溴酚藍(lán)的色條帶走至近底端1cm 時(shí)，停止電泳。關(guān)閉電源。然后從電泳槽內(nèi)小心取出凝膠板。
2)染色
a)用刀片或薄板將凝膠板外的兩塊玻璃板輕輕撬開(kāi)，使凝膠傾伏在其中一塊玻璃板上。
b)用刀片在凝膠上沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標(biāo)記樣品順序。
c)然后將分離膠小心移入染色器皿中。
d)在染色器皿中加入100 ml 染色液，加蓋，染色3 小時(shí)。
3)脫色
將染色液倒去。染色的凝膠用水漂洗數(shù)遍，瀝干水后置于染色皿中，再加入100 ml 脫色液，加蓋，脫色至染色的凝膠經(jīng)脫色后能清晰顯示出蛋白條帶止。
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