(一) 原理
將SPA偶聯(lián)至Sepharose－4B上后，利用親和層析 來提取人和某些動物的IgG，這樣可以省去制備第二抗體。該法特別適用于單克隆抗體的研究。該法提取IgG與利用IgG純化SPA原理是一致的。
(二) 材料與試劑
1．Sepharose－4B瓊脂 糖
2．SPA
3．溴化氰
4．0.10Mol/L NaHCO3液
5．pH3.2鹽酸－*液
6．生理鹽水
7．待提取的IgG樣品
8．層析柱 (2cm×10cm)
9．磁力攪拌器
10．751分光光度計(jì)
(三) 操作方法
1．Sepharose－SPA的制備 在50ml三角燒瓶中加入蒸餾水20ml，加入固體溴化氰1.4g，加蓋后溫和振蕩，使之溶解。倒入已盛有瓊脂糖珠(4B)的燒杯中，立即攪拌，并滴加2mol/L NaOH溶液，邊加邊攪拌，使pH維持在11。反應(yīng)6min后，倒入布氏漏斗，迅速以預(yù)冷的0.1mol/L NaHCO3溶液500ml抽濾洗滌已活化的瓊脂糖珠。洗滌時(shí)間不超過90Sec，立即將此瓊脂糖珠加入預(yù)先以0.1mol/L NaHCO3平衡的SPA液10ml中(10mg/ml)，于4℃攪拌16h～20h，此即為Sepharose－SPA的吸附劑。
2．將Sepharose－SPA低速離心5min，以生理鹽水洗滌2－3次，除去未偶聯(lián)上的SPA，然后裝入2cm×10cm層析柱中，用生理鹽水200ml洗至洗液OD280nm＜0.02。
3．親和層析 將欲提取的IgG樣品用生理鹽水做1:5稀釋后，加入Sepharose－SPA層析柱，以生理鹽水洗脫，流速20ml/h。IgG被柱上的SPA吸附住，其它蛋白質(zhì)隨洗脫液流出。以生理鹽水洗至洗脫液的OD280nm＜0.02為止。
4．解吸附 以pH2.0鹽水－*緩沖液進(jìn)行洗脫，將洗脫下來的蛋白液迅速以1mol/L的NaHCO3液中和至pH 7.0，此即為提純的IgG。
5．將收集的IgG液測定其蛋白含量、活性和純度后，濃縮、分裝、低溫保存?zhèn)溆谩?br>6．Sepharose－4B－SPA柱復(fù)生 采用7mol/L尿素洗柱后，再用生理鹽水洗滌，zui后用PBS液平衡后，可重復(fù)使用。
（四）結(jié)果判定
1．IgG的收集量。
2．IgG的純度鑒定 可采用圓盤電泳或免疫電泳進(jìn)行鑒定。
3．IgG的活性鑒定 可采用抗該IgG的ELISA試驗(yàn)，以鑒定IgG的活性。
會員1.png)