一、目的：
學(xué)習(xí)稀堿法提RNA的原理與技術(shù)。
二、原理：
由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有*法、去污劑法和鹽酸胍法。其中*法又是實(shí)驗(yàn)室zui常用的。組織勻漿用*處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡(jiǎn)單。濃鹽法是用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3?4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀堿法使用稀堿（本實(shí)驗(yàn)用0.2%NaOH溶液）使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA（本實(shí)驗(yàn)）或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
酵母含RNA達(dá)2.67?10.0%，而DNA含量?jī)H為0.03?0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。
三、器材與試劑：
1．器材：
①*粉（市售）。
②鮮酵母（市售）。
③pH試紙（pH1?10）。
④臺(tái)天平（100g）。
⑤燒杯100ml（×1）。
⑥量筒50ml（×1）、10ml（×1）。
⑦抽濾瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。
⑧吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1）。
⑨離心機(jī)5000r?min-1。
2．試劑：
①0.2%氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。
②乙酸（A?R）。
③95%乙醇。
④無水乙醚（C?P）。
⑤氨水（C?P）。
⑥10%硫酸溶液：濃硫酸（比重1.84）10ml，緩緩 傾于水中，稀釋至100ml。
⑦5%*溶液：5gAgNO3 溶于蒸餾水并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中。
⑧苔黑酚?三氯化鐵試劑：將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3 ?6H2 O。臨用時(shí)配制。
四、操作步驟：
1．RNA的提?。褐?g*粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10?15分鐘（4000r?min-1）。取上清液，加入95%乙醇30ml，邊加邊攪。加畢，靜置，待*沉淀，過濾。濾渣先用95%乙醇洗2次（每次約10ml），繼用無水乙醚洗2次（每次10ml），洗滌時(shí)可用細(xì)玻棒小心攪動(dòng)沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可作鑒定。
2．鑒定：取上述RNA約0.5g，加10%硫酸液5ml，加熱至沸1?2分鐘，將RNA水解。
（1）取水解液0.5ml，加苔黑酚?FeCl3試劑1ml，加熱至沸1分鐘，觀察顏色變化。
（2）水解液2ml，加氨水2ml及5%*溶液1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。
編輯： viviank
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