去除交叉反應(yīng)性抗體實(shí)驗(yàn)步驟，細(xì)胞裂解緩沖液
0.1mol/L 醋酸鈉
1mol/L NaCl
用 0.45um 濾膜過(guò)濾細(xì)胞裂解緩沖液，室溫貯存。每 1L 培養(yǎng)細(xì)菌需要大約 100 ml 細(xì)胞裂解緩沖液。
NaOH(1mol/L)
Tris-緩沖鹽溶液（TBS) 和含 0.2%(m/V) *的 TBS
Triton X-100
酶和緩沖液
*
使用分子生物學(xué)級(jí)的*。加入固體洧菌酶以輔助裂解細(xì)菌。
胰 DNA 酶 I
在細(xì)胞裂解液中加入固體 DNA 酶 I 消化染色體 DNA。
抗體
制備用于文庫(kù)篩選的抗體
利用蛋白 A-Sepharose 親和層析制備的 IgG 片段，本方案可獲得效果。用蛋白 Aipharoae 介質(zhì)的親和層析法，請(qǐng)見(jiàn) Harlow 和 Lane 法（1999)。
培養(yǎng)基
培養(yǎng)液
需要 1 升合適的大腸桿菌培養(yǎng)液。
離心和轉(zhuǎn)子
Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子
Sorval SS-34 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子
設(shè)備
親和層析柱
5 ml 塞有玻璃棉的塑料注射器或 Bi-Rad Poly-Prep 柱子均適用。
溴化氫活化的 Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech) 或 Affi-GellO(Bia Rad)
載體和菌株
大腸桿菌作為制備表達(dá)文庫(kù)的宿主菌
方法
1. 將適當(dāng)菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培養(yǎng)物培養(yǎng)至靜止期。
2. 用 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 離心 20 min 收獲菌體。
3. 棄去培養(yǎng)基，倒置離心管排出殘留培養(yǎng)液。
4. 將沉淀物重懸于 100 ml 的細(xì)胞裂解緩沖液中。
5. 加入 200 mg *，于室溫溫育菌液 20 min。
6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。
7. 于 4°C 溫育菌液 1 h, 或溫育至上清由混濁變清亮且黏度降低。
8. 將細(xì)菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 轉(zhuǎn)頭）離心 20 min, 小心將上清液倒入另一個(gè)燒杯內(nèi)。
9. 用 1mol/LNaOH 將上清液 pH 調(diào)至 9.0。
10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法檢測(cè)裂解液中蛋白的濃度。
11. 將提取液驟冷至 0°C, 并按操作說(shuō)明將菌體蛋白質(zhì)結(jié)合于溴化氫活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。
12. 使用前，用含 0.2%(m/V) *的 TBS 平衡與大腸桿菌提取物結(jié)合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 樹(shù)脂。
13. 每通過(guò)親和層析純化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定體積的與大腸桿菌抗原相偶聯(lián)的樹(shù)脂。IgG 和偶聯(lián)的樹(shù)脂混勻后，在轉(zhuǎn)鼓中于室溫溫育 12~18 h。
14. 將勻漿液裝到親和層析柱上。用 TBS 洗脫抗體。收集洗脫液（每管 0.2 柱床體積）至OD280 降為 0。合并各管抗體，并將親和純化抗體貯存于-20°C, 以備免疫篩選時(shí)用。去除交叉反應(yīng)性抗體實(shí)驗(yàn)步驟
會(huì)員1.png)