凝膠染色方法對蛋白質分辨率的影響

提高雙向凝膠電泳的分辨率是蛋白質組學研究尚待解決的課題及技術發(fā)展方向，影響蛋白質分辨率的因素較多，其中凝膠染色方法對蛋白質分辨率的影響不可忽視，它影響了實驗的顯像結果，直接干預了后續(xù)的質譜鑒定。ELISA試劑盒目前，在蛋白質組學領域中廣泛應用的是考馬斯亮藍染色法和銀染法兩種。

考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue，CBB G-250)的化學名稱為二甲花青亮藍，偏酸性，與蛋白質的堿性基團結合，顏色由棕黃色轉為深蘭色?？捡R斯亮藍染色法可以達到微克級檢測水平，著色程度與蛋白量的線性動力學相關范圍廣，適合定量分析。該法由于較低的成本、使用方便及與下游的質譜鑒定技術的良好相容性，而得到了非常廣泛的使用。然而微克級的檢測水平使它漏檢了相當多的低豐度蛋白質，日益成為蛋白質組學的瓶頸，因此大量提高染色靈敏度的研究及各種染色液的配方和方法應運而生，經文獻報道的方法眾多，評價不一。我們的試驗選擇了3種常用的考馬斯亮藍染色法進行比較，測得傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的靈敏度可達幾百納克，膠體考馬斯亮藍染色法能檢測到幾十納克蛋白，改良考馬斯亮藍染色法則可達幾納克蛋白水平?？捡R斯亮藍染色法經過改進能獲得高的蛋白質檢測靈敏度，甚至可與銀染媲美。

銀染法是利用銀離子與氨基酸共價結合，還原劑的加入使與膠內蛋白質結合的銀離子形成金屬銀而顯色。文獻報道檢測限度可低于1 ng的蛋白質，其靈敏度比傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法高約100倍，被廣泛應用于蛋白質組學研究，但銀染步驟復雜，繁瑣，且著色線性動力學的覆蓋范圍窄，導致蛋白質差異顯示的不準確性，同時由于游離銀離子及相關試劑的存在，給后續(xù)分析及鑒定帶來一定的實際困難。我們的實驗只采用了一種銀染法，結果顯示銀染法的靈敏性高于所有考馬斯亮藍染色法，4 ng的蛋白質條帶也能顯現(xiàn)，但蛋白質鑒定成功率低。ELISA試劑盒

蛋白質檢測靈敏度的影響因素

蛋白質著色顯示的靈敏性既取決于染色試劑，如上述分析，又與染色過程中涉及的有機溶劑及離子有關。在考馬斯亮藍染色法和銀染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有機溶劑的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白質固定在凝膠中或阻滯它們在凝膠中擴散。同時也去除電泳過程中的干擾染色過程的物質，如去垢劑、還原劑和緩沖液等成分。乙酸的作用既是輔助固定蛋白質同時又維持染液的酸性度，以利于考馬斯亮藍與蛋白質結合。他們的存在有利于獲得背景清晰、信噪比高的圖像。由于3種有機溶劑的相似作用，我們在膠體考馬斯亮藍染色法及改良考馬斯亮藍染色法里，保留乙醇作為*的固定清潔劑，用磷酸替代乙酸發(fā)揮酸化作用，結果顯示兩種考馬斯亮藍染色法獲得的圖像背景比傳統(tǒng)考馬斯亮藍染色法的要清晰，條帶也銳利。

在膠體考馬斯亮藍染色法中，酸性的乙醇介質中加入硫酸銨，使得著色劑形成膠體染色顆粒，膠本身可不被顯著著色，蛋白染色靈敏度得以提高。而在改良考馬斯亮藍染色法中，在高酸、高離子環(huán)境下，蛋白質的葡糖胺和天冬酰胺酸質子化，更利于與染色劑發(fā)生結合。因此2種染色法呈現(xiàn)出背景清晰、蛋白檢測多的圖像，且在改良考馬斯亮藍染色法中由于高酸、高離子存在，靈敏度出現(xiàn)提高，幾接近銀染水平。

甲醛在銀染中發(fā)揮還原劑作用，使結合在蛋白質上的銀還原而顯色。甲醛濃度影響銀染效果，濃度一般為400～500μl/L。甲醛濃度較高時膠顏色發(fā)黃，背景色混雜，難以發(fā)現(xiàn)目的點;濃度較低不僅染色時間延長，而且不易著色。銀的絡合劑*防止自由銀離子還原為金屬銀，可減少非特異染色，降低背景染色，其濃度一般為0.1～0.2mg/L。該絡合劑用量過多，膠顏色過深;少則不足以螯合掉游離的銀離子，膠顏色發(fā)黑。ELISA試劑盒

質譜兼容性的影響因素

考馬斯亮藍G-250在一定的pH時，這種染料-蛋白質復合物被*解聚。適應于蛋白質的質譜鑒定;而銀染使用的銀離子及醛類造成肽間的相互交連，影響膠內蛋白質酶解及洗脫，降低了蛋白質質譜分析的氨基酸序列覆蓋率，考馬斯亮藍染蛋白質鑒定的成功率在60%～80%之間，遠高于銀染鑒定的成功率(30%～60%);而我們的結果是，前者的質譜鑒定成功率為50%，后者僅為5%。鑒于此，我們也在不斷地尋找新的方法，以提高銀染鑒定的成功率。