在正常的細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，僅S期是DNA合成期。當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，損傷修復(fù)的DNA合成主要發(fā)生在其他細(xì)胞周期，稱非程序性DNA合成，又稱程序外DNA合成(unsched，aledDNA synthesis，UDS)。因此發(fā)現(xiàn)UDS增高，即表明DNA發(fā)生過(guò)損傷。本實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)評(píng)價(jià)保健食品的誘變性和(或)致癌性。用這種篩選方法可以檢測(cè)出一些短期體外實(shí)驗(yàn)法所不能檢出的誘變劑和(或)致癌劑。

    在體外培養(yǎng)細(xì)胞中，UDS水平較低(充其量只有半保留復(fù)制DNA的5％)?？赏ㄟ^(guò)同步化培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于Gl期并用藥物(常用*)抑制殘留的半保留DNA復(fù)制后檢測(cè)UDS。同步化培養(yǎng)可用缺乏必需氨基酸*的同步化培養(yǎng)基ADM使DNA合成的始動(dòng)受阻而使細(xì)胞同步于Gl期。在這些半保留DNA合成明顯抑制和阻斷了的細(xì)胞中，UDS即可用3 H一胸腺嘧啶核苷的摻人增加，通過(guò)放射自顯影或液體閃爍計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)量。

一、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)材料

l.受試材料*。

2．待檢樣品及已知對(duì)照致癌物。

3．3 H一胸腺嘧啶核苷(5～10μCi／mI，30Ci／mmol)；14C-胸腺嘧啶核苷終濃度為0．0lμCi／ml(50mci／mmol)。

4．細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基：

EMEM培養(yǎng)基      85％

胎牛血清      15％

*和*    終濃度分別為100U／ml及100mg／ml

5．同步化培養(yǎng)基：

不含*的EMEM培養(yǎng)基(ADM)   9％

小牛血清     1％

*和*    終濃度分別為100u／ml及100mg／ml

6．Hanks*(HBSS)：

貯液A：

氯化鈉(NaCl)    16．O g

氯化鉀(KCl)   8．0 g

*(MgSO4·7H20)     2．O g

氯化鎂(MgCl2·6H20)    2．O g

    混合后溶于800ml雙蒸水中。另取無(wú)水氯化鈣2．8g溶于100ml雙蒸水中。將上述兩溶液混合后，加水至1000ml，加入氯仿2ml，保存于4℃冰箱中。細(xì)胞

貯液B：

*    3．0或1．2 g

(Na2HP04·12H20或Na2HP04·2H2O)

磷酸二氫鉀(KH2PO4)     0．5 g

葡萄糖    20．0 g

氯化鎂(MgCl2·6H20)     2．0 g

混合后溶于800ml雙蒸水中。然后加入100ml 0．4％酚紅溶液(取酚紅1g，溶于3mllmol／L氫氧化鈉中，待*溶解后，加入雙蒸水中至250ml)，加水至1000ml，加入氯仿2ml，保存于4℃冰箱中。

貯液C：1．4％*以雙蒸水配制

應(yīng)用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分裝于玻璃容器內(nèi)；高壓滅菌，4℃保存。用前加入1．4％*，將pH調(diào)整至7．2～7．4。

7．碳酸緩沖液(無(wú)鈣、鎂的Dulbecco氏磷酸緩沖液pH7．4)：

氯化鈉(NaCl)       8．0 g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)       0．2 g

氯化鉀(KCl2)       0．2 g

*(Na2HP04·12H2O)      2．9 g

混合后溶于800ml雙蒸水中。待*溶解后，調(diào)節(jié)pH至7．4，加水至1000ml。

8．顯影液及定影液(放射自顯影用)：

Kodak D-196顯影液：水500ml，順次溶入米吐?tīng)?硫酸對(duì)甲氨基*)2g，無(wú)水亞硫酸鈉72g，對(duì)苯二酚8．8g，*48g，*4g，加水至1000ml。停顯液：98％冰乙酸15m1．加水至1000ml。

Kodak F一5定影液：水100ml，依次溶人海波240g，無(wú)水亞硫酸鈉15g，28％乙酸48ml，硼酸(結(jié)晶)7．5g，鉀礬15g，加水至1000ml。

9．1mol／L高氯酸：

取70％高氯酸8．57ml，加水至100ml為lmol／L。

10．閃爍液。細(xì)胞

2，5一二苯基嗯唑(PPO)5g，1，4一雙一[5一苯基唔唑基2]一苯(POPOP)300mg溶于甲苯中，使成1000ml。

11．陽(yáng)性物對(duì)照物可用7，12二甲基苯并蒽，2一乙酰氨基芴，4一硝基喹啉氧化物·N甲基亞硝胺。